过表达Sirt1对高糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖与TGF-β1表达的影响

目的 :探讨过表达沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,Sirt1)对高糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖与转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:体外培养人肾小球系膜细胞(HMC),利用Sirt1重组慢病毒载体感染细胞获得过表达Sirt1蛋白的人肾小球系膜细胞并分为4组:1NG+LV-CTL组:正常葡萄糖(5.5 mmol/L)+空白对照慢病毒感染;2HG+LV-CTL组:高糖(30 mmol/L)+空白对照慢病毒感染;3NG+LV-Sirt1组:正常葡萄糖+Sirt1慢病毒感染;4HG+LV-Sirt1组:高糖+Sirt1慢病毒感染;再设立3组未感染细胞作为对照,分别为:1NG组(正常葡萄糖);2NM组(正常糖+甘露醇组24.5 mmol/L);3 HG组(高糖处理),培养不同时间后以CCK-8法检测细胞增殖情况;实时定PCR和Western blot法检测各组细胞TGF-β1m RNA和蛋白表达水平。结果:1通过重组慢病毒感染,嘌呤霉素筛选,获取稳定过表达Sirt1蛋白的人肾小球系膜细胞系;2与NG组相比较,各时间点HG、HG+LV-CTL、HG+LV-Sirt1组CCK8的吸光值均明显升高(P均<0.01)。处理24、48 h后,HG+LVSirt1组的吸光值明显低于HG、HG+LV-CTL组。3与NG组相比较,HG、HG+LV-CTL、HG+LV-Sirt1组TGF-β1 m RNA以及蛋白水平明显上调,差异均有显著性(P均<0.01);HG+LV-Sirt1组的TGF-β1 m RNA以及蛋白水平明显低于HG、HG+LV-CTL组(P均<0.01);而NG、NM、NG+LV-CTL及NG+LV Sirt1组间相比较,无统计学差异(P>0.05)。结论 :过表达Sirt1能够抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖与TGF-β1表达,Sirt1可能成为防治糖尿病肾病的作用靶点。

Sirt1基因shRNA干扰载体构建及其对细胞增殖和凋亡的影响

本实验目的在于构建Sirt1 shRNA干扰载体,探讨Sirt1对HepG2、A549和293T细胞增殖和凋亡的影响。设计并合成Sirt1的shRNA序列,重组到pGenesil-1.0质粒载体中筛选出pGenesil-1.0-Sirt1阳性克隆并测序。将构建好载体转染HepG2、A549和293T细胞,用RT-PCR、Western blot检测各细胞中Sirt1表达水平,MTT测细胞增殖活性,加入阿霉素处理三组细胞后,用MTT检测细胞凋亡情况。结果表明成功构建Sirt1 shRNA干扰载体,各细胞株中Sirt1表达水平明显下降,Sirt1 shRNA克隆细胞株增殖能力降低,阿霉素处理后,各细胞株抗凋亡能力明显减弱,Sirt1在维持细胞增殖及抗细胞DNA损伤凋亡方面发挥重要作用,为进一步研究提供理论依据。