舍格伦综合征A抗原（SSA60）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及胶体金快速检测方法的建立

目的在巴斯德毕赤酵母中表达舍格伦综合征A抗原（SSA60）并建立胶体金快速检测方法。方法表达质粒pPIC9k—SSA60用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和斑点免疫金渗滤法（DIGFA）鉴定。结果表达产物SSA60的分子量约60000，高拷贝巴斯德毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的，表达量占分泌总蛋白60％以上，产物浓度为600～950mg／L。DIGFA检测85份舍格伦综合征（SS）患者血清和30份正常人血清，抗SSA检测阳性率为95．3％（81／85），特异度为100％（30／30）。与德国欧蒙ENA酶斑点法对比检测的符合率为96．5％（111／115），差异无统计学意义（P〉O．05）。结论SSA60在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，DIGFA简便、快速、准确，可用于临床自身免疫病的诊断。

原发性干燥综合征患者血清sHLA-G检测分析

目的:探讨血清可溶性人类白细胞抗原-G(sHLA-G)含量与原发性干燥综合征(pSS)的关系。方法:用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测71例pSS患者和69例健康对照者血清中sHLA-G含量。结果:69例健康人血清sHLA-G的浓度最低为1.43U/mL,最高为32.76U/mL,平均值范围(14.35±8.88)U/mL。71例pSS患者sHLA-G的浓度最低为1.05U/mL,最高为28.82U/mL,平均值范围(8.43±7.24)U/mL。pSS患者血清sHLA-G水平显著低于健康对照组(P<0.01)。结论:pSS患者血清sHLA-G水平显著降低,sHLA-G水平降低可能参与了pSS的病理过程。

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。

人干燥综合征B抗原的基因克隆及融合表达

目的:建立新的检测方法,克隆并表达人干燥综合征B抗原(SS-B)。方法:应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆SS-B全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(W estern b lot)试验。结果:PCR产物约为1 200 bp,与预期1 224 bp接近,测序结果与Gen-Bank报道的完全一致。pGEX-5T-SS-B重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和W estern b lot结果显示融合蛋白相对分子质量为71 000,具有天然SS-B的免疫原性。结论:成功克隆表达SS-B,为下一步研究奠定了基础。

人干燥综合征A抗原重组体的构建及鉴定

目的克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-52kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSA-52kDcDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源Hela细胞总RNA作为模板,反转录RT-PCR扩增人干燥综合征SSA-52kD抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对DNA测序结果进行鉴定分析。结果RT-PCR扩增产物为1447bp。重组质粒PET-30a-SSA-52kD经BglⅡ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。结论成功克隆人SSA-52kD基因,并构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。

人干燥综合征A抗原克隆表达与重组蛋白及其临床应用研究

克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-60kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原建立ELISA法用于自身抗体的临床检测。根据GenBank中检索到的人SSA-60kD cDNA序列,在5’和3’非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,经RT-PCR扩增SSA-60kD抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-60kD。对后者进行酶切鉴定、测序和分析。在大肠杆菌中表达,产生重组融合蛋白。RT-PCR扩增产物为1632bp。PET-30a-SSA-60kD经EcoR I和V双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中一致。利用金属螯合亲和层析法和纯化,得到了高纯度的SSA-60kD重组蛋白。成功克隆人SSA-60kD基因,并构建PET-30a-SSA-60kD,建立了ELISA方法,检测了风湿病患者血清中抗SSA-60kD自身抗体。

外周血人软骨糖蛋白-39在原发性干燥综合征患者中的检测价值

目的探究外周血人软骨糖蛋白-39在原发性干燥综合征患者中的检测价值。方法选取2011年7月至2014年7月本院收治的首次诊断为原发性干燥征的患者50例,为原发性干燥综合征组,另外选取同期来本院体检健康志愿者50例,作为健康对照组;抽取静脉血,测量并对比患者和志愿者红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CPR)和人软骨糖蛋白-39水平等,并检查对比口唇腺体淋巴细胞病灶数和唾液流率等。结果原发性干燥综合征组患者外周血人软骨糖蛋白-39明显高于健康对照组志愿者(t=25.207,P<0.001)。原发性干燥综合征患者外周血人软骨糖蛋白-39水平与口唇腺体淋巴细胞病灶数(r=0.46,P=0.001)、ESR(r=0.48,P=0.001)、CRP(r=0.70,P<0.001)、RF(r=0.41,P=0.004)、IgG(r=0.50,P<0.001)成正相关,与唾液流率(r=-0.42,P=0.003)成负相关。有并发症的原发性干燥综合征患者外周血人软骨糖蛋白-39水平(252.4±23.5)μg/L明显高于无并发症患者(174.6±21.7)μg/L,差异有统计学意义(t=11.678,P<0.001)。结论人软骨糖蛋白-39可作为判断原发性干燥综合征疾病活动度的指标,其水平明显升高还可提示患者可能发生并发症,为较客观、全面地反映pSS病情的指标,可广泛应用于临床。

人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达

目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原(SS-B)。方法:PCR扩增SS-B基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SS-B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定。结果:PCR产物约为1200 bp,与预期1224 bp接近,pPIC9k-SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的分子量约48 000,高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的,表达量占分泌总蛋白60%以上,产物浓度为800- 900mg/L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS-B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论:SS-B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础。

以皮疹为首发症状的儿童原发性干燥综合征并文献复习

目的探讨以皮疹为首发症状的儿童原发性干燥综合征(pSS)的临床诊治要点。方法选择2019年8月2日,成都市妇女儿童中心医院收治的1例以皮疹为首发症状的pSS患儿为研究对象。回顾性分析其临床病例资料,并对2000年1月至2020年4月的国内外数据库中,关于儿童pSS的相关文献进行复习。本研究符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。结果本例pSS患儿为女性,年龄为13岁11个月,因主诉"皮疹3^+年,加重4个月"收入本院。(1)临床表现:皮疹位于患儿颜面部及双上肢,呈红色水肿性红斑,并部分融合;伴脱发、发热、右眼结合膜充血,不伴眼干、口干、皮肤干燥及腮腺肿大等临床表现。(2)主要实验室检查结果:血清类风湿因子(RF)水平升高,抗核抗体(ANA)免疫球蛋白(Ig)G呈阳性,抗干燥综合征(SS)A、B抗体均呈阳性;双眼角膜荧光染色(+),唇腺活组织检查示腺体中淋巴细胞密集性聚集、局灶性淋巴细胞浸润改变,腮腺增强CT检查结果显示双侧腮腺稍增大、密度欠均匀、散在微小囊状扩张导管。(3)治疗及转归:免疫调节及免疫抑制治疗,以及局部(眼)给予滴眼液外用后,皮疹及眼部症状均好转,出院后继续上述治疗,病情基本痊愈。对其随访至14岁8个月时,疾病无复发。pSS文献复习结果:儿童pSS临床表现多样,确诊该病的检查较复杂;对儿童pSS目前尚无特异性治疗方法,主要为系统性治疗配合局部治疗。结论以皮疹为首发症状的儿童pSS较罕见,血清学抗体检测、外分泌腺体组织病理学与影像学检查,有助于该病患儿的早期诊断。