人抗凝血酶Ⅲ纳米膜过滤工艺优化

目的考察Asahi Kasei（旭化成）公司纳米膜过滤人抗凝血酶Ⅲ（Human AntithrombinⅢ,ATⅢ）的回收率,优化纳米膜过滤工艺。方法选取旭化成公司3种不同规格型号的纳米膜Planova~15N,Planova~20N和Planova~Bio EX进行ATⅢ过滤回收率考察,通过留取生产工艺中不同阶段不同蛋白浓度的制品,优化过滤蛋白总量,确定纳滤米过滤工艺位置。结果蛋白浓度16 mg/m L的ATⅢ通过Planova~20N过滤获得蛋白总量最高,ATⅢ蛋白及效价回收率也较高,为最佳纳滤蛋白浓度。结论通过本研究筛选出Planova~20N,最佳纳滤蛋白浓度为16 mg/m L,经去除病毒验证其对细小病毒的去除率LRV〉4.0,最终确定纳滤工艺在人抗凝血酶Ⅲ工艺中超滤浓缩后,既符合生产工艺要求并可获得高回收率。

人抗凝血酶Ⅲ研究进展

人抗凝血酶Ⅲ(Human Antithrombin,hATⅢ)是机体抗凝系统发挥其生理功能的主要因子,对血液循环、血浆渗透压平衡、止血抗凝、抗炎等机制均具有重要作用,与各种疾病的表征高度相关。该文综述了hATⅢ的基因结构、蛋白结构、生物功能以及其重组表达等方面的研究进展,对hATⅢ的研究进行了展望,旨在为hATⅢ研究工作者提供参考。

抗人ATⅢ单克隆抗体的研制

目的：建立人抗凝血酶Ⅲ（ Ａ Ｔ Ⅲ）的 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测试剂盒及 Ａ ＴⅢ的纯化提供试剂准备。方法：用 Ａ ＴⅢ进行 ２ 次基础免疫、２ 次加强免疫的方法免疫 Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠，经间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 的方法筛选杂交瘤细胞株，通过吸收试验、免疫印迹试验等进行特异性分析。结果：筛选出１５ 株分泌抗人 Ａ ＴⅢ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，对其中３ 株（ Ｂ４、 Ｂ５、 Ｂ７）作进一步研究，３ 株杂交瘤细胞分泌抗体亚型均为 Ｉｇ Ｇ１ 型，３ 株细胞培养上清滴度平均达到４×１０３，小鼠腹水滴度平均达到 ４×１０６，３ 株抗体均具抗人 Ａ ＴⅢ的特异性。结论：所筛选的单抗为 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测试剂盒的制备及 Ａ ＴⅢ的纯化提供了试剂准备。

病理水平抗凝血酶Ⅲ室内质控血浆的制备及应用评价

目的研制病理水平的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)室内质控品,并对其稳定性和质控效果进行评估。方法用病理水平的AT-Ⅲ混合血浆为血浆制备来源,以"复合酶稳定剂AFP+抑肽酶+25mmol/L的pH7.4磷酸缓冲液、60g/L蔗糖、20g/L聚乙二醇2万衍生物、10g/L小牛血清清蛋白、0.5g/L叠氮钠"为保存介质制备AT-Ⅲ质控品;采用L-J质控图比较自制质控品和西门子定值质控品的质控效果;观察自制质控品在室温、4℃、-80℃冰箱保存条件下的稳定性。结果自制病理水平AT-Ⅲ质控品定值为32.9%,与定值质控品质控效果一致,可监测到试剂、仪器、环境等因素改变引起的失控,在-80℃冰箱保存条件下可稳定5个月,复融后须在室温2h内、4℃冰箱2d内使用完成。结论自制病理水平AT-Ⅲ质控品的稳定性和质控效果均符合室内质控品的要求,可应用于实验室的室内质控。

人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的制备与质量评价

目的建立一种从废弃的Cohn法组份IV沉淀中提取制备人抗凝血酶Ⅲ浓缩制剂的工艺,并通过与国外已上市人抗凝血酶-Ⅲ产品进行质量及相关药代动力学参数对比,评价制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的质量情况。方法对制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂和国外已上市人抗凝血酶-Ⅲ产品ThrombateⅢ^(®)进行活性、纯度、肝素亲和力等关键质量属性的检测对比,并进行小鼠体内消除半衰期对比研究,评价2种制品的质量相似性。结果制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂活性为56.7 IU/mL,ThrombateⅢ^(®)活性为53.4 IU/mL;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的纯度为99.1%,ThrombateⅢ^(®)的纯度为97.3%;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂中具肝素亲和活性的分子约为89.1%,ThrombateⅢ^(®)分子中具肝素亲和活性的分子约为84.6%;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的比活为10.98 IU/mg,ThrombateⅢ^(®)的比活为9.98 IU/mg;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂在小鼠体内的消除半衰期为5.19 h,ThrombateⅢ^(®)在小鼠体内的消除半衰期为4.85 h;经t检验分析,制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂中的hAT-Ⅲ与ThrombateⅢ^(®)中的hAT-Ⅲ在小鼠血清中的药物消除速率差异无统计学意义(P=0.2531)。结论与国外已上市同类产品ThrombateⅢ^(®)相比,制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的各项关键质量指标均非劣于ThrombateⅢ^(®)说明本文所述人抗凝血酶-Ⅲ的制备工艺能有效从废弃的Cohn法组份IV沉淀中提取高质量的人抗凝血酶-Ⅲ制剂,能有效提高人血浆综合利用效率。

口腔扁平苔藓患者血清差异蛋白表达检测及意义

目的探讨口腔扁平苔藓(OLP)患者血清差异蛋白表达及意义。方法选择6例OLP患者(观察组)和6例健康志愿者(对照组),抽取空腹静脉血后采用苯酚抽提法提取血清蛋白,Bradford法测定蛋白含量,双向荧光差异凝胶电泳法分离检测差异蛋白点,液相色谱-质谱联用技术鉴定差异蛋白。选择其中研究较少的蛋白,采用Western blotting法检测两组蛋白相对表达量。结果两组血清差异蛋白点(583±183)个,其中重复性好的蛋白差异点20个,质谱分析蛋白序列鉴定出12种蛋白质。12种蛋白质中,7种(补体C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型Ig A、补体C9、β-1-金属结合球蛋白)在观察组血清中表达降低,5种(结合珠蛋白、铜蓝蛋白、载脂蛋白AⅠ、维生素D、人类因子B)表达升高。观察组血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相对表达量均低于对照组,载脂蛋白AⅠ高于对照组(P均<0.01)。结论 OLP患者血清中存在12种差异蛋白质,血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白表达均降低,载脂蛋白AⅠ表达升高,其发病可能与免疫功能降低及感染有关。

两种方法检测人抗凝血酶-Ⅲ活性的对比分析

目的对比分析两种检测人抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ,AT-Ⅲ）活性的方法。方法分别用手工法和仪器法检测AT-Ⅲ活性,手工法根据《欧洲药典》8.0中AT-Ⅲ含量检测2.7.17项的要求进行检测,仪器法是利用法国STAGO全自动血凝仪及其配套试剂进行检测。同时对两种方法检测结果的直线回归相关系数、重复性、准确性进行验证。结果两种方法的直线回归相关系数均〉0.99,RSD均〈10%,回收率均在80%~120%之间。结论两种方法的一致性良好,且仪器法更省时省力,效率更高。

人抗凝血酶Ⅲ转基因羊的外源基因漂移风险分析

目的:研究转基因羊发生基因漂移的可能性。方法:利用实时荧光定量PCR技术检测人抗凝血酶Ⅲ转基因羊及与其密切接触的野生型山羊、转乙肝表面抗原基因羊、转β-干扰素转基因羊、狗、鸡和鹅的血样中人抗凝血酶Ⅲ基因的含量。结果:人抗凝血酶Ⅲ转基因只在人抗凝血酶Ⅲ转基因羊血液中检测呈阳性。结论:人抗凝血酶Ⅲ基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移,提示转基因羊对于环境是安全的。

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者与血栓前分子标记物的相关性研究

目的探讨阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)与血栓前分子标记物的相关性。方法选择我院2010年至2011年所有诊断为OSAHS的580例患者,分为轻度患者为180例,中度为290例,重度为110例,健康对照组为50例;应用ELISA法对上述所有研究对象进行人凝血酶原片段F1+2、P-选择素、血浆抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、D-二聚体、血红蛋白(Hb)等检测。结果 OSAHS患者组D-二聚体水平和Hb均高于健康组,而且随着病情的加重逐步升高。轻度组P-选择素、人凝血酶原片段F1+2、血浆抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)三项指标无明显差异,中度组及重度组均有差异(P<0.01)。轻度组D-二聚体、Hb、AT-Ⅲ水平与健康组比较有统计学意义(P<0.05),而P-选择素、F1+2与健康组比较无统计学意义(P>0.05)。结论 OSAHS患者血栓前分子标记物高于健康人。

人血浆Cohn法组分Ⅳ沉淀的综合利用研究

目的采用全层析工艺从废弃的Cohn法组分Ⅳ沉淀(Cohn fraction Ⅳ precipitate, Cohn F Ⅳ)中提取抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ, AT Ⅲ)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)和人血白蛋白进行综合利用。方法将Cohn F Ⅳ溶解并澄清处理后进行SD法病毒灭活,得到上柱前料液,再依次采用阴离子交换层析、肝素亲和层析+α1-AT Select串联亲和层析、疏水层析以及分子筛层析后分别得到AT Ⅲ和α1-AT的纯品以及主要含有人血白蛋白的组分。对AT Ⅲ和α1-AT分别进行纯度、活性以及肝素亲和力等方面的检测,并评价其质量属性。结果采用此方法获得的AT Ⅲ纯度可达99%以上,比活达10 IU/mg以上,肝素亲和力达80%以上;α1-AT纯度同样可达99%以上,比活达1.5 PU/mg以上。结论本研究所述方法可成功将Cohn F Ⅳ中的AT Ⅲ、α1-AT以及人血白蛋白等几种目前最具备提取利用价值的蛋白进行有效的分离,在人血浆综合利用方面具有较高的利用价值。