hBMP-2转染自体兔骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质的成骨实验研究

目的 探讨人骨发生蛋白 2 (hBMP - 2 )转染兔自体骨髓基质细胞 (rMSCs)的骨生成诱导作用以及附和异体兔脱钙骨基质 (DBM )后的成骨效能。方法 取兔自体骨髓基质细胞培养扩增 ,用脂质体介导的方法转染人骨发生蛋白 2基因 ,将转染和未转染人骨发生蛋白 2基因的自体骨髓基质细胞附和于异体兔脱钙骨基质形成新的生物植骨材料 ,连同空白及单纯脱钙骨基质对照组植入兔前肢肌袋和桡骨缺损。 2、 4、 6、 8周分别取材进行大体、放射线和病理观察。结果 肌袋试验 6周后 ,转染人骨发生蛋白 2基因的自体骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质材料中出现骨组织细胞 ,未转染组和单纯异体兔脱钙骨基质组为纤维组织。骨缺损试验中 ,三组均能产生骨的形成和缺损的修复 ,但仍然是转染复合材料组的骨修复再生能力最大。结论 局部应用hBMP -

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽 hBMP-3m cDNA,纯化后连接入pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR 和Hind 酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m.利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌 A-grobacteriumtumefaciens LBA4404.以烟草 NicotianatabacumL. 无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg/L潮霉素 Hygromycin,Hyg 的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,WesternBlot结果表明已有微量BMP表达.

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆，及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列，将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游，受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带，分子量约为１２ｋＤ，约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后，可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间，在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成，证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ），表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段，包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在，用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤，可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白，植入小鼠肌肉内，第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成，第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验，２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性，糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白-3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒 p CAMBIA- h BMP- 3 m直接转入根癌农杆菌 LBA440 4 ,以烟草无菌苗叶盘为外植体 ,通过农杆菌介导法进行遗传转化 ,获得了在含 2 5 mg/L潮霉素 (Hy-gromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株 ,经 PCR检测呈阳性 ,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白 -

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。

人骨形成蛋白1-cDNA基因工程表达产物抗体的制备及鉴定

应用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白(human bone morphogenetie protein,HBMP-1)的N端片段作为免疫原,免疫新西兰大白兔,成功地制备了抗人骨形成蛋白的抗血清,经免疫转移电泳证实该抗血清有较好的特异性,用ABC免疫组织化学方法在正常和恶性肿瘤骨的石腊切片上检测抗血清效价为1:100～1:1000,免疫组化染色结果表明,HBMP存在于人胎下颌骨新生的骨质和骨细胞中,颌骨骨肉瘤和软骨肉瘤的瘤细胞呈BMP强阳性反应,这一结果表明,骨的生长、形成和骨肿瘤的发生与BMP密切相关。

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13μg/mL.

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的hBMP 2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程hBMP 2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为 10 2个氨基酸的hBMP 2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达hBMP 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :hBMP 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比hBMP 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。

人骨形成蛋白3全长基因转化烟草的初步研究

将含有人骨形成蛋白3(hBMP-3)全长基因的质粒pCAMBIA1300-hBMP-3通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中,以烟草无菌苗叶盘为外植体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,获得了抗潮霉素(Hy-gromycin,Hyg)的再生植株,通过潮霉素抗性鉴定及PCR检测,初步确定人骨形成蛋白-3(hBMP-3)全长基因已整合到烟草的基因组中。

骨形成蛋白与胶原膜联合应用促进即刻种植体周骨组织再生的实验研究

目的 比较单独应用胶原膜和胶原膜与人骨形成蛋白 (hBMP)联合应用引导即刻种植体周骨缺隙骨再生的效果。方法 将复合有hBMP和无hBMP的相同种植体分别植入 12只成年杂种狗下颌拔牙窝 ,覆盖胶原膜。于术后 2、4、8、12周每次处死狗 3只 ,取材 ,扫描电子显微镜观察。结果 在种植体周骨缺隙部 ,有hBMP组 2周时即有大量新骨形成 ,8周时骨缺隙完全由成熟的骨质充填 ,而无hBMP组 ,12周时种植体周骨缺隙由仍未完全成熟的骨质充填 ;在种植体与骨紧密接触的界面上 ,有hBMP组比无hBMP组新骨形成和成熟早。结论 国产可吸收胶原膜能有效地引导即刻种植体周骨缺隙的骨组织再生 ;胶原膜与hBMP联合应用能明显地促进即刻种植体周骨缺隙的骨组织再生及种植体骨界面上新骨的形成和成熟。

股骨头坏死愈胶囊联合重组人骨形态发生蛋白-2治疗激素性股骨头坏死的作用机制

目的:探究股骨头坏死愈胶囊联合重组人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)治疗激素性股骨头坏死的机制。方法:将30只3周龄雌性SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组和骨愈组,每组10只,模型组和骨愈组采用臀肌注射甲基强的松龙40 mg/kg,阿莫西林溶液10 mg/kg,每48 h注射1次,连续注射8周。对照组注射等体积的生理盐水。造模8周后,骨愈组给予股骨头坏死愈胶囊水溶液0.4 g/kg灌胃,1次/d,连续8周,模型组大鼠给予体积生理盐水灌胃。MRI观察髋关节影像学改变和组织病理学观察。获取正常大鼠和造模大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),分组培养:对照组、巨噬细胞系统(MPS)组、骨愈组、hBMP-2组和骨愈+hBMP-2组。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色测定成骨分化情况,油红染色测定成脂分化情况。通过RT-qPCR和Western Blot法评估成骨相关基因的表达水平。结果:体内实验中,MRI扫描和组织学分析显示,造模成功且股骨头坏死愈胶囊可防止大鼠股骨头坏死模型的骨丢失。体外实验显示,股骨头坏死愈胶囊联合重组人骨形态发生蛋白-2共处理的骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化能力明显优于MPS组,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。股骨头坏死愈胶囊联合hBMP-2可使骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达和钙结节的形成提高,其成脂分化被抑制。Western Blot法结果显示,与MPS组相比,骨愈组和骨愈+hBMP-2组表达更高水平的BMP-2、Runx2和ALP,差异有统计学意义(P<0.05),表达更低水平的过氧化物酶增殖物激活受体α(PPARα),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:中药股骨头坏死愈胶囊联合重组人骨形态发生蛋白-2,可显著改善骨髓间充质干细胞成脂和成骨之间平衡能力,促进成骨分化,可成为预防或延缓骨转移相关股骨头坏死进展的有效组合。

人骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达

目的探讨含有人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)cDNA的真核表达载体在兔骨髓基质干细胞(MSCs)中的转录及表达情况,为进一步进行多基因转染MSCs复合纳米仿生骨治疗骨缺损实验提供材料。方法用电穿孔方法将真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2转染至兔MSCs中,荧光显微镜及流式细胞学检查观察转染效果、检测转染效率,定量RT-PCR方法观察hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录情况,免疫组织化学及westernblot方法检测hBMP-2蛋白表达情况,ALP活性定量测定检测hBMP-2蛋白功能。结果电穿孔方法将重组质粒转染至兔MSCs中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染效率为(42.7±2.1)%,转染24h后定量RT-PCR方法检测到hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录片断,免疫组织化学观察到hBMP-2蛋白呈强阳性表达,westernblot方法可见18KDhBMP-2蛋白条带,转染组细胞ALP活性明显提高(P>0.05)。结论pIRES2-EGFP-hBMP2通过电穿孔方法导入兔MSCs,并在其中有效表达,发挥生物学作用。