利用人脑类器官构建胶质瘤侵袭模型

目的:利用人脑类器官建立胶质瘤侵袭模型并用于评价胶质瘤细胞侵袭能力。方法:通过神经定向诱导分化形成人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)来源的脑类器官;将人脑类器官与人胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)共培养,构建胶质瘤侵袭模型;检测不同类型GSCs在脑类器官中的侵袭深度,评价其侵袭能力。结果:(1)人ESCs经诱导分化,于第31天形成大量神经上皮芽结构,免疫荧光染色显示神经干细胞特异性蛋白Sox2、Pax6和nestin表达,提示脑类器官形成;(2)与脑类器官共培养后,胶质瘤细胞侵入脑类器官中生长,成功建立胶质瘤侵袭模型;(3)不同类型GSCs在脑类器官中的侵袭深度存在差别。结论:本研究建立了胶质瘤侵袭类器官模型,该模型可用于评价GSCs的侵袭能力。

脑胶质瘤分子病因相关组织芯片CyclinB1表达及其临床意义的研究

目的:探讨CyclinB1在针对胶质瘤发生、发展相关组织芯片中的表达及意义。方法:构建针对人脑胶质瘤发生、发展分子机制研究的组织芯片,应用免疫组化EnVision法检测CyclinB1在组织芯片标本中的表达,分析其表达率及表达强度。结果:CyclinB1染色阳性表达主要位于细胞核。在71例人脑胶质瘤组织中,CyclinB1阳性表达率为52.1%,与正常成人脑组织(18.2%)比较,差异有统计学意义(χ2=5.15,P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级人脑胶质瘤组织CyclinB1阳性表达率分别为11.2%、44.0%、65.2%和71.4%;病理级别与CyclinB1的阳性表达率呈正相关(r=0.959,P<0.05)。两种胶质瘤细胞系多细胞球体SHG44细胞和GBM细胞的CyclinB1阳性表达率高于神经干细胞、脑肿瘤干细胞(χ2=9.60,P<0.01);人胚胎脑组织、裸鼠移植瘤和裸鼠骨髓中也呈过表达。结论:CyclinB1的表达强度能客观反映被测细胞的增殖活性,处于非增殖状态的干细胞低表达或不表达。它的高表达与肿瘤恶性程度相一致。

IL13修饰雷公藤红素/人参总皂苷脂质体的制备及其抑制BT325细胞作用

目的制备白介素13(IL13)修饰雷公藤红素/人参总皂苷脂质体,并评价其对人脑胶质瘤细胞BT325的抑制作用。方法薄膜分散法制备脂质体,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水相缩合法将IL13锚定在粒子表面,考察其形态、粒径、Zeta电位、IL13修饰密度的质量分数、包封率、体外释放。以药脂比(雷公藤红素/卵磷脂)、胆脂比、水合时间、IL13投料比为影响因素,粒径、Zeta电位、聚合物分散性指数(PDI)为评价指标,正交试验优化制备工艺。荧光定性和胞内药物定量法评价BT325细胞摄取行为,MTT法和流式细胞仪法分别测定脂质体抗肿瘤和诱导细胞凋亡作用。结果最佳条件为药脂比1∶20,胆脂比1∶4,水合时间45 min,IL13投料比0.6%。所得脂质体均一圆整,粒径分布较窄,平均粒径(118.3±3.2)nm,Zeta电位(-38.3±3.4)m V,IL13修饰密度的质量分数0.3%,雷公藤红素和人参总皂苷包封率分别为(82.3±2.9)%和(71.2±3.2)%,24 h累计释放度分别为(42.5±4.9)%和(24.3±2.1)%。它可显著促进BT325细胞摄取,IC50为(2.8±0.3)μg/m L(以雷公藤红素计),低于IL13未修饰脂质体和物理混合物(雷公藤红素-人参总皂苷)。当雷公藤红素质量浓度为10μg/m L时,它还能诱导84.3%的BT325细胞发生凋亡。结论 IL13修饰雷公藤红素/人参总皂苷脂质体在体外表现出明显的人脑胶质瘤细胞BT325靶向性和体外抗肿瘤作用。

人脑恶性胶质瘤生物治疗的临床研究

报告27例人脑胶质瘤生物治疗的临床结果，LAK细胞／IL－2治疗组12例，其中复发性星形细胞瘤10例，丘脑胶质瘤2例，有效率为33％。TIL／IL－2治疗组15例，星形细胞瘤及少枝胶质瘤均为术后肿瘤残留着，分别为12例和3例，有效率为47％。二组总有效率为40％。临床研究结果表明LAK细胞及TIL／IL-2是治疗人脑胶质瘤安全、有一定疗效的新途径。

FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞凋亡的影响

目的:研究FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤U251细胞凋亡的影响。方法:Real-time PCR检测35例脑胶质瘤及相应癌旁组织中FUBP1 mRNA的表达。设计并合成FUBP1基因特异性的siRNA,转染U251细胞。转染后,western blot检测转染后FUBP1蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果:与癌旁组织相比,FUBP1 mRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,U251细胞中的FUBP1蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论:FUBP1基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。

超抗原活化人淋巴细胞疫苗在SCID鼠体内抗人脑胶质瘤研究

目的 探讨超抗原SEC激活的人外周血单个核细胞 (HuPBMC)在动物体内抗人脑胶质瘤的疗效。方法 建立人脑胶质瘤和转输人外周血单个核细胞于SCID小鼠体的人肿瘤 人淋巴细胞的嵌合模型 ,并用SEC治疗之。结果 在肿瘤增殖曲线 ,增殖比、荷瘤鼠生存期 ,瘤组织病理形态等多项指标证实SEC +HuPBMC组的疗效明显优于单纯SEC和单纯HuPBMC组。结论 SEC作为免疫治疗赋活剂 ,在荷人脑肿瘤·人淋巴细胞SCID鼠体内的联合免疫治疗作用优于任何单一治疗组 ,为其临床应用奠定了理论基础。

人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞U87MG凋亡的影响

目的观察人参皂甙Rh2对胶质瘤细胞凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法将培养的人胶质瘤细胞U87MG随机分为人参皂甙Rh2组、人参皂甙Rh2+尼莫地平组和对照组。人参皂甙Rh2组在常规培养细胞时加入20μg/ml的人参皂甙Rh2,人参皂甙Rh2+尼莫地平组在人参皂甙Rh2组培养细胞时加入浓度为10μmol/L的尼莫地平。利用流式细胞仪检测U87MG细胞凋亡,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测U87MG细胞内钙离子浓度。结果与对照组相比,人参皂甙Rh2促进U87MG细胞凋亡(P<0.05),且增加细胞内游离钙离子浓度(P<0.05);尼莫地平显著减少人参皂甙Rh2引起的U87MG细胞凋亡(P<0.05)。结论人参皂甙Rh2可以通过增加细胞内游离钙离子浓度促进U87MG细胞凋亡。

神经胶质瘤细胞与人脑微血管内皮细胞之间STAT3信号的交互作用

目的:探讨神经胶质瘤细胞(A172/U251)与人血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)之间STAT3信号通路的交互作用。方法:建立A172、U251细胞与HBMEC的Transwell共培养体系,ELISA检测A172、U251细胞及其分泌因子VEGF对HBMEC分泌IL-6的影响,Western blotting检测HBMEC与A172/U251细胞共培养30 min时HBMEC及其分泌因子IL-6对A172/U251细胞STAT3蛋白及其磷酸化状态p-STAT3的影响,CCK-8、Transwell侵袭实验分别检测HBMEC及其分泌因子IL-6对A172/U251细胞增殖和侵袭的影响。结果:VEGF(50 ng/ml)组和共培养组(HBMEC分别和A172,U251细胞共培养)HBMEC的IL-6的表达量明显高于对照组(P<0.01)。共培养30 min时,A172/U251细胞的IL-6(50ng/ml)组、共培养组及(共培养+AZD1480)组的STAT3/p-STAT3蛋白的表达明显高于对照组(P<0.01),(共培养+AZD1480)组的胶质瘤细胞STAT3/p-STAT3蛋白的表达能力显著低于共培养组(P<0.01)。IL-6(50 ng/ml)组,共培养组及(共培养+AZD1480)组的A172/U251细胞增殖及侵袭能力明显高于对照组(P<0.01),(共培养+AZD1480)组的细胞增殖及侵袭能力显著低于共培养组(P<0.01)。结论:神经胶质瘤细胞与人脑微血管内皮细胞之间存在信号交互作用,且与JAK2/STAT3信号通路密切相关。

人脑胶质瘤中DNA拓扑异构酶-Ⅱα的表达及其对胶质瘤U87MG细胞凋亡的影响

目的研究DNA拓扑异构酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα,Topo-Ⅱα)基因在人脑胶质瘤中的表达改变及其对胶质瘤U87MG细胞凋亡的影响。方法 Real-time PCR检测25例脑胶质瘤及相应癌旁组织中Topo-ⅡαmRNA的表达。将Topo-Ⅱα基因特异性的siRNA转染U87MG细胞。转染后,Western Blot检测转染后Topo-Ⅱα蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果与癌旁组织相比,Topo-ⅡαmRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,U87MG细胞中的Topo-Ⅱα蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论 Topo-Ⅱα基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。

NK细胞对人脑胶质瘤细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用的实验研究

目的观察NK细胞对人脑胶质瘤细胞(HGC)裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法将分离、培养的NK细胞和HGC按实验设计移植于随机分配的4组(A组:无细胞移植组;B组:HGC移植组;C组:HGC+人NK细胞移植组;D组:人NK细胞移植组)裸鼠体内,观察肿瘤的生长情况。结果 A组和D组无移植细胞生长,B组和C组肿瘤出现时间分别为(9.23±1.64)d、(15.26±1.53)d,B组和C组比较差异有显著性(t=4.328,P=0.000)。结论移植到裸鼠体内的人NK细胞能有效抑制移植的HGC的生长。

人脑胶质瘤细胞SWO-38促进体外培养的小脑皮质神经元的生存和生长

目的:观察人脑胶质瘤细胞SWO-38分泌产物对小脑皮质神经元生存和生长的影响。方法:SWO-38细胞与3天龄大鼠小脑皮质神经元联合培养。结果:SWO-38细胞对小脑皮质神经元的生存以及突起长度的增加有明显的促进作用。结论:SWO-38细胞可能释放对小脑皮质神经元有营养活性的神经营养因子。

Yes相关蛋白对人脑胶质瘤干细胞增殖的促进作用

目的探讨Hippo信号传导通路下游转录共激活子Yes相关蛋白(YAP)在人脑胶质瘤干细胞中调控作用。方法利用FACS分选得到CD133-和CD133+细胞,利用PCR和Western blot法检测2组细胞间YAP表达的差异;利用小发夹RNA干扰CD133+细胞中YAP的表达,通过MTT法分析YAP干扰表达后人脑胶质瘤干细胞增殖情况。结果 YAP m RNA和蛋白在CD133+细胞中表达明显高于CD133-细胞;YAP干扰表达后CD133+细胞增殖能力减弱。结论 YAP参与人脑胶质瘤干细胞的功能调控,对人脑胶质瘤干细胞的增殖起到促进作用。

分化人脑胶质瘤干细胞的放疗耐受性

目的:比较不同剂量的放射治疗对人脑胶质瘤干细胞及其分化的胶质瘤细胞的杀灭作用,探讨胶质瘤干细胞与放疗耐受的相关性。方法:分离、培养并纯化人脑胶质瘤干细胞,并同时诱导纯化的肿瘤干细胞向胶质瘤细胞分化,对人脑胶质瘤干细胞及其分化后的胶质瘤细胞分别以0、2、3、5、8、12Gy的6MVX线照射后,继续培养72h,采用MTT法检测细胞的增殖情况。结果:由胶质瘤干细胞分化出的子代胶质瘤细胞对放射治疗的耐受性下降,且随照射剂量增大,细胞生长抑制显著(F=125.971,P<0.001)。结论:脑胶质瘤干细胞分化后,对放射治疗的耐受性下降。

Hes-1在人脑胶质瘤干细胞分化过程中的动态表达及意义

目的研究在体外培养的人脑胶质瘤干细胞诱导分化过程中Hes-1蛋白表达的动态变化。方法对体外培养的人脑胶质瘤干细胞进行诱导分化,于未分化、分化第3、7d收集标本,行Hes-1蛋白免疫荧光染色后流式细胞术检测标本中阳性细胞比例;Hes-1分别与CD133、GFAP、MAP2、MBP蛋白双标免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜下观察Hes-1蛋白表达强度及细胞类型的变化。结果随着人脑胶质瘤干细胞的分化,Hes-1蛋白阳性细胞比例由未分化至分化第3d、第7d有明显下降(P<0.01);Hes-1蛋白在CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞均可表达,但在较幼稚的细胞中表达较强,随着细胞分化成熟,其表达明显减弱,分化第7d时大部分分化成熟的肿瘤细胞(MAP2、GFAP和MBP阳性细胞)中表达极弱或不表达。结论随着人脑胶质瘤干细胞的分化,Hes-1蛋白表达的阳性细胞比例和强度均明显下降,提示Hes-1表达的动态变化可能与调控人脑胶质瘤干细胞的分化过程有关。

FUBP1与c-myc在脑胶质瘤中的表达及调控关系

目的:探讨FUBP1与c-myc在脑胶质瘤组织中的表达及其相关性以及脑胶质瘤细胞中二者之间的调控关系。方法:Real-time PCR检测30例脑胶质瘤及相应癌旁组织中FUBP1和c-myc的表达。设计并合成FUBP1基因特异性的siRNA,转染U251细胞。转染后,Western blot检测FUBP1和c-myc蛋白的表达。结果:与相应癌旁组织相比,胶质瘤组织中FUBP1和c-myc的表达均显著上调,二者呈显著正相关;转染siRNA-FUBP1后FUBP1和c-myc蛋白的表达均显著下调。结论:FUBP1和c-myc在脑胶质瘤中存在表达异常,而且二者的表达存在正相关性,FUBP1在脑胶质瘤细胞中能够上调c-myc的表达。

脑胶质瘤中hTERT和PCNA的表达及意义

目的探讨脑胶质瘤中人端粒酶逆转录酶(hTERT)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达特征及其意义。方法用原位杂交方法检测75例脑胶质瘤患者和4例脑外伤患者脑组织标本中hTERT的表达;用免疫组化SABC法检测PCNA表达。结果75例胶质瘤患者脑组织标本中hTERT阳性表达40例,4例正常脑外伤患者脑组织中hTERT表达均为阴性。hTERT表达与胶质瘤分级呈正相关。胶质瘤中PCNA阳性表达31例,其中hTERT阳性21例、阴性10例。hTERT阳性组与阴性组之间PCNA阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.01)。结论hTERT阳性表达率与胶质瘤病理分级和PCNA阳性表达率呈正相关。hTERT可能通过影响PC-NA的表达参与脑胶质细胞瘤的发生、发展过程。

地塞米松对嘧啶亚硝脲诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的观察地塞米松(DEX)对嘧啶亚硝脲(ACNU)诱导的人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法分别以ACNU、DEX、ACNU联合DEX,作用于体外培养的人脑胶质瘤细胞系SHG-4460h,通过细胞形态学及流式细胞仪分析检测细胞凋亡。结果①形态学观察:ACNU组、ACNU联合DEX组,大部分瘤细胞呈现细胞凋亡的形态学改变。而DEX组及正常对照组仅个别细胞出现上述形态改变。②荧光显微镜观察及流式细胞仪分析:ACNU组、ACNU联合DEX组有典型的凋亡峰,且其瘤细胞的凋亡率明显高于DEX组及正常对照组瘤细胞的凋亡率(P<0.01),但ACNU组的SHG-44细胞的凋亡率与ACNU联合DEX组相差不显著(P>0.05)。结论DEX对ACNU诱导人脑胶质瘤细胞凋亡没有明显影响。

亚硒酸钠对脑胶质瘤干细胞生长抑制效应及细胞内活性氧的影响

目的:研究亚硒酸钠对人脑胶质瘤干细胞的生长抑制效应及细胞内活性氧的影响。方法:使用不同浓度的亚硒酸钠(0.5μmol/L、1.5μmol/L、3.0μmol/L)对人脑胶质瘤干细胞进行侵染,分别通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及荧光检测仪检测亚硒酸钠对人脑胶质瘤干细胞的增殖及活性氧(ROS)含量的影响。结果:亚硒酸钠对人脑胶质瘤干细胞具有明显的抑制作用,且随亚硒酸钠浓度的增加对人脑胶质瘤干细胞细胞生长抑制作用逐渐加强。结论:亚硒酸钠能抑制人脑胶质瘤干细胞的生长,并可增加其细胞内ROS的含量。

人脑胶质瘤细胞来源外泌体的提取鉴定及微环境中的摄取

目的探讨提取、鉴定及观察细胞对外泌体在微环境中的摄取,为后续开展胶质瘤外泌体相关的研究建立稳定的提取方法,以及更清楚地观察到外泌体奠定基础,为今后研究提供一定的参考。方法运用超速离心法从人脑胶质瘤细胞培养上清液中分离外泌体以及观察在肿瘤细胞微环境中肿瘤细胞对外泌体的摄取,通过透射电子显微镜观察外泌体的大小、形态特点,通过马尔文粒径分析确定外泌体粒径的大小,应用Western blotting法进行外泌体特异性抗原分子CD63、TSG101的鉴定,采用荧光共聚焦显微镜观察胶质瘤细胞摄取外泌体。结果通过透射电子显微镜观察到从人脑胶质瘤U251细胞的培养上清液中分离出来的呈圆形杯盘样结构的囊泡样物质,其外形呈典型的杯状和双凹圆盘的扁平球囊体且具备完整的膜结构,粒径大小为30~150 nm,Western blotting结果显示其表达外泌体特异性蛋白CD63、TSG101;外泌体通过细胞内吞噬作用形成、分泌和释放,通过荧光共聚焦显微镜可以证实其有效摄取外泌体,主要集中于细胞质。结论人脑胶质瘤U251细胞中提取分离得到具有双层膜结构茶托样囊泡物质,鉴定其为外泌体,并能观察细胞摄取外泌体集中分布于细胞质。

生存素反义寡核苷酸对人脑胶质瘤U87细胞株MMP-2及TIMP-2表达的影响

目的:研究生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人脑胶质瘤U87细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metallo-proteinase-2,TIMP-2)表达的影响,探讨生存素ASODN治疗胶质瘤的可行性。方法:经脂质体介导将生存素ASODN转染人脑胶质瘤细胞株U87,用荧光显微镜检测转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法检测转染细胞生存素、MMP-2及TIMP-2表达改变。结果:荧光显微镜检测结果显示生存素ASODN可成功转染U87细胞。与对照组相比,转染组细胞生存素、MMP-2、TIMP-2 mRNA和蛋白的表达均显著降低。结论:生存素ASODN转染可有效抑制U87细胞生存素基因的表达,并降低其MMP-2、TIMP-2表达,生存素ASODN可能用于胶质瘤基因治疗。