宫颈癌组织中MCM4、CDC6的表达及其与HPV_(16/18)感染的相关性

目的:研究微小染色体维持蛋白4(minichromosome maintenance proteins4,MCM4)、细胞分裂周期蛋白(cell divi-sion cycle6,CDC6)在宫颈癌组织中的表达及其与人乳头状瘤病毒16/18型(human papilloma virus16/18type,HPV16/18)感染的相关性及其临床意义。方法:收集2006-2007年间山西大同市第五人民医院病理科经病理证实的50例宫颈癌、20例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ、20例CINⅡ-Ⅲ、20例正常宫颈组织石蜡标本,以免疫组织化学法检测这些组织标本中MCM4、CDC6的表达,同时采用PCR技术检测HPV16/18的感染情况。结果:(1)在宫颈癌组织中MCM4、CDC6表达的阳性率显著高于CIN和正常宫颈组织(均P<0.05),且MCM4、CDC6阳性表达率与宫颈癌病理分级和淋巴转移相关(均P<0.05),而与年龄分组、临床分期无关(均P>0.05)。(2)HPV16/18感染在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中的阳性率依次升高(P<0.05),但与宫颈癌患者年龄、临床分期、病理分级、淋巴转移无关(均P>0.05)。(3)宫颈癌组织中MCM4和CDC6的表达呈正相关(r=0.390;P<0.05);MCM4和CDC6表达均与HPV16/18感染相关(r=0.634,P<0.05;r=0.386,P<0.05)。结论:宫颈癌及CIN组织中MCM4、CDC6表达的改变与HPV16/18感染密切相关,共同影响CIN的发展及宫颈癌的发生与发展。

四君子汤含药血清通过抑制RhoA/Rac1/Cdc42通路影响卵巢癌细胞的上皮间质转化

目的探索四君子汤含药血清对卵巢癌细胞增殖迁移、侵袭及上皮间质化的影响,并初步研究其作用机理。方法体外培养人卵巢癌细胞(SKOV3)和人卵巢上皮细胞,随机分为空白对照组、舒尼替尼组、四君子汤Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。噻唑蓝法检测各组SKOV3细胞和人卵巢上皮细胞增殖变化情况;划痕实验和侵袭(transwell)实验检测各组SKOV3细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹分析法检测各组SKOV3细胞上皮型钙粘蛋白(Ecadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)和细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)蛋白表达情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组SKOV3细胞RhoA、Rac1和Cdc42 mRNA表达变化。结果各组人卵巢上皮细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,舒尼替尼组SKOV3细胞存活率、划痕愈合率、侵袭数量、N-cadherin、Vimentin蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。四君子汤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组SKOV3细胞存活率、划痕愈合率、侵袭数量、N-cadherin、Vimentin蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达依次降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达依次升高(P<0.05),呈剂量依赖性。四君子汤Ⅲ组上述指标和舒尼替尼组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论四君子汤含药血清能够抑制人卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质化,可能与RhoA/Rac1/Cdc42信号通路激活受阻相关。

小白菊内酯通过CDCA4调控PI3K/AKT通路抑制三阴性乳腺癌转移

目的研究小白菊内酯(PTL)对乳腺癌MDA-MB-231细胞转移干预作用的影响及其相关机制。方法配置0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L的PTL处理乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h,采用MTS法和划痕实验检测不同浓度的PTL对MDA-MB-231细胞活力和迁移能力的影响。利用转染技术建立空白组,阴性对照组和CDCA4转染组;用PI3K抑制剂处理细胞24 h,建立PI3K抑制剂组和对照组。利用蛋白质印迹法和RT-PCR技术检测各组细胞人类细胞分裂周期相关基因4(CDCA4)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(PIK3CA)及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)等信号分子的蛋白水平和mRNA的表达水平。结果PTL可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移,并且能够下调CDCA4、PIK3CA、AKT的蛋白和mRNA表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。与空白组和阴性对照组相比,CDCA4转染后的PIK3CA、AKT的mRNA和蛋白的表达量明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,PI3K抑制剂组的AKT、CDCA4的蛋白表达量明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论PTL可能通过下调CDCA4的表达,减少PIK3CA的突变从而抑制PI3K/AKT信号通路的激活,降低乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力。

细胞分裂周期相关基因8表达水平与肿瘤发展及预后关系的研究进展

细胞分裂周期相关基因8(CDCA8)表达水平异常可影响多种信号通路,尤其是对于多种癌症的发生及发展过程起到增殖促进作用,相关机制主要包括影响细胞分裂周期、作为PI3K和p53等信号通路的共性调控因子加速癌症发生与发展、影响趋化因子细胞通路等。同时,CDCA8表达水平与肿瘤预后存在关联。本文综述了CDCA8与膀胱癌、女性生殖系统肿瘤、前列腺癌等疾病发生及发展的关系、作用机制及CDCA8与肿瘤不良预后、病理分期等的关系,为多种肿瘤的治疗和预后预测提供新思路。

补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用

目的:比较补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用。方法:采用上述4种不同的含药血清对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞株进行处理,通过细胞寿命实验、流式细胞仪、RT-PCR、Western blot方法研究不同中药对衰老细胞周期及其相关基因(P16^(INK4)、Cyclin D1及PCNA)的mRNA转录和蛋白表达的影响。结果:补肾、益气中药对衰老细胞周期有一定的促进作用,并可下调衰老细胞增殖抑制基因P16和周期蛋白Cyclin D1的mRNA/蛋白表达;上调细胞周期促进增殖基因PCNAmRNA/蛋白的表达。而健脾、活血中药对细胞周期及其相关基因和蛋白表达的作用不明显。结论:补肾、益气方药对细胞周期有促进作用,其中的作用可能是通过促进P16途径的基因表达来实现。

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的:从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2(CDC2),并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法:从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果:RT-PCR扩增出约894bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论:从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。

HERG蛋白对胃癌细胞凋亡及细胞周期分布的影响

目的研究人eag相关基因(HERG)蛋白表达对胃癌细胞凋亡及细胞周期分布的影响。方法构建HERG-siRNA载体;将构建的载体转染胃癌细胞SGC7901,氨基糖苷类抗生素G418进行转染细胞的稳定筛选并克隆化,从蛋白和电流水平鉴定转染细胞。采用流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡情况;采用透射电子显微镜技术观察胃癌细胞超微结构的变化;采用流式细胞仪检测胃癌细胞细胞周期分布的变化。结果 HERG-siRNA可以阻断胃癌细胞中的HERG电流,可以诱导胃癌细胞出现凋亡;在透射电子显微镜下观察到典型的凋亡细胞的形态学改变;HERG-siRNA可以阻止胃癌细胞由G1期进入S期。结论 HERG-siRNA可抑制HERG蛋白及相应钾电流,从而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞G1/S期转化,具有潜在的抗癌作用。

沉默CDC25A基因后肝癌裸鼠移植瘤组织中差异表达基因的筛选

目的:探讨应用基因芯片技术筛选出可能受细胞分裂周期因子25A(cell division cycle 25A,CDC25A)调控的基因,阐明并验证CDC25A对肝癌相关基因的表达具有调控作用。方法:本课题组前期通过siRNA干扰技术沉默人肝癌HepG2细胞中CDC25A的表达并成功构建了肝癌裸鼠移植瘤模型。基于上述研究成果,在本研究中应用Affymetrix基因表达谱芯片技术进一步筛选沉默CDC25A后肝癌移植瘤组织中的差异表达基因,并进行GO及KEGG分析,应用qPCR对部分差异表达基因进行验证。结果:通过芯片技术筛选出沉默CDC25A基因的肝癌移植组织中的差异表达基因188个,其中上调基因78个、下调基因110个。这些差异表达基因主要涉及细胞增殖、细胞凋亡、蛋白复合物结合、细胞外间隙等方面,参与黏着斑、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)受体相互作用等通路的改变。q PCR对部分差异表达基因验证的结果显示,HIPK2 mRNA表达上调,微纤丝关联蛋白5(microfibrillar-associated protein 5,MFAP5)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1,CCND1)mRNA表达下调,与芯片检测结果一致。结论:应用人基因表达谱芯片技术成功筛选出沉默CDC25A后肝癌裸鼠移植瘤组织中的差异表达基因,为探究CDC25A影响肝癌细胞生长提供了支持线索。

人食管癌相关基因4原核表达载体构建及其重组蛋白对食管癌EC-18细胞周期的影响

目的构建人食管癌相关基因4(ECRG4)原核表达载体,表达纯化ECRG4重组蛋白,验证ECRG4重组蛋白的生物学功能。方法利用DNA重组技术构建ECRG4重组蛋白原核表达载体。转化大肠杆菌,表达纯化ECRG4重组蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析ECRG4重组蛋白纯度。用磷酸盐缓冲液(PBS)和10μg/ml ECRG4重组蛋白分别处理食管癌EC-18细胞48h,流式细胞术检测肿瘤细胞周期的变化。结果SDS-PAGE分析显示获得了高纯度的ECRG4重组蛋白,成功构建了ECRG4蛋白原核表达载体。PBS对照组与ECRG4重组蛋白组G1期细胞比例分别为(60.4±2.1)%、(71.6±1.8)%(t=25.695,P=0.002),S期细胞比例分别为(24.6±1.4)%、(16.5±1.0)%(t=36.905,P=0.001),G2/M期细胞比例分别为(15.0±1.1)%、(11.9±0.8)%(t=6.471,P=0.023),提示ECRG4重组蛋白能诱导EC-18细胞G1期阻滞。结论成功构建ECRG4原核表达载体,ECRG4重组蛋白在食管癌中具有活性生物学功能。

大蒜新素对巨细胞病毒感染细胞周期蛋白基因表达谱的影响

目的 探讨人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)对感染细胞周期蛋白基因表达谱的影响及大蒜新素的干预效应。方法 利用基因芯片技术对比分析大剂量大蒜新素处理正常细胞和感染细胞 (MOI=2 .5 ) 72h以及同期培养的感染和正常细胞周期相关蛋白基因 (2 39条 )表达谱的变化。结果 感染细胞有 2 4条 (10 .0 4 % )基因发生有意义的差异性表达 ;其中 9条表达增加 ,15条表达降低。大蒜新素对 11条HCMV感染所致表达改变的基因无影响 ;使HCMV感染下调作用消除的基因有 11条 ;使HCMV感染上调作用消除的基因有 2条。另外 ,药物对感染细胞和正常细胞基因表达均有影响的有 2条 ;仅引起正常细胞基因表达改变的有 3条。结论 HCMV感染使部分细胞周期相关蛋白基因差异性表达可能是HCMV导致宿主细胞周期紊乱的原因之一。大蒜新素至少可使HCMV所致 13条基因差异性表达作用消除 ,提示药物干预了病毒对细胞周期的影响。

EB病毒感染上调胃癌BGC823细胞的增殖和侵袭能力

目的探讨EB病毒感染对胃癌细胞增殖伏况和侵袭能力的影响。方法用B95-8细胞体外培养获得EB病毒并感染人胃癌BGC823细胞,MTT法检测细胞增殖状况,羊膜侵袭实验检测细胞侵袭能力,流式细胞技术测定细胞周期变化．RT-PCR法检测感染后胃癌细胞中的病毒基因。结果 EB病毒感染胃癌BGC823细胞后,代表细胞增殖能力的A比值提高34．34％,体外侵袭羊膜的细胞数增加28．72％。S期细胞比例自36．7％增高为41．9％,G0／G1期细胞比例减少。在EB病毒感染的BGC823细胞中可以检测到EB病毒核抗原1和EB病毒编码RNA 1两种病毒基因,未检测到潜伏膜蛋白1和EB病毒核抗原2。结论EB病毒感染能够促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力、干扰其细胞周期,有可能在胃癌的发生、发展过程中发挥作用。

抗增殖蛋白与肝癌的研究进展

抗增殖蛋白(prohibitin,PHB)在细菌、酵母、原虫、哺乳类动物等不同种属的细胞中广泛分布,且高度保守,参与细胞周期调控、增殖与凋亡、核转录以及维持线粒体形态等多种生物进程。PHB是肝发育的必要因素,PHB1蛋白在人类肝癌细胞株中表达下降,PHB基因缺失会抑制人肝癌细胞株细胞增殖、引起细胞凋亡。本综述系统性阐述抗增殖蛋白在肝癌发生、发展过程中的作用,有助于我们揭示相关机制,为肝癌的防治提供理论基础。