人内皮抑素endostatin基因的融合表达纯化及活性测定

目的:获得有活性的人内皮抑素(endostatin)融合蛋白. 方法:从人胎肝组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出endostatin基因,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,纯化,MTT法测定endostatin蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的抑制活性. 结果:RT-PCR获得endostatin基因,扩增产物在10 g/L 琼脂糖凝胶上显示为1条扩增条带,约573 bp,与预计大小一致.将PCR产物连入PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经KpnⅠ,NotⅠ酶切鉴定、测序验证.构建pTRX-endo表达载体,在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合.重组蛋白经纯化,MTT 法测定重组人内皮抑素蛋白具有生物学活性.人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)受到明显抑制,具有剂量依赖抑制关系,ED50=550μg/L. 结论:人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖.

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。

重组人血管内皮抑制素治疗非小细胞肺癌的疗效分析

目的 探讨重组人血管内皮抑制素治疗晚期驱动基因阴性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)疗效及对血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag)水平的影响。方法 选取2022年1月—2023年1月福建医科大学附属漳州市医院收治的晚期驱动基因阴性NSCLC患者60例,根据随机数字表法分为观察组与对照组,各30例。对照组采用程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein1,PD-1)抑制剂联合化疗治疗,观察组采用PD-1抑制剂联合化疗+重组人血管内皮抑制素治疗。比较两组的临床疗效、生存质量、血清CEA、SCC-Ag水平及不良反应发生情况。结果 观察组总有效率为70.00%,高于对照组的60.00%,差异无统计学意义(P> 0.05)。治疗后,观察组癌症患者生命质量测定量表(functional assessment of cancer therapy generic scale,FACT-G)生理状况、社会/家庭状况、情感状况及功能状况评分均高于对照组(P <0.05)。治疗后,观察组血清CEA、SCC-Ag水平均低于对照组(P <0.05)。两组各项不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 在PD-1抑制剂联合化疗治疗基础上,采用重组人血管内皮抑制素治疗晚期驱动基因阴性NSCLC能提高临床疗效,改善患者生存质量及血清CEA、SCC-Ag水平,且安全性良好。

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPIC9K,获得的重组质粒pPIC9K＿EDN转化毕节酵母GS115,构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastorisGS115(pPIC9K＿EDN)。SDS＿PAGE分析结果显示:人内皮细胞抑制素在重组酵母GS115(pPIC9K＿EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵,经甲醇诱导48h,生物量达到250OD,分泌量为150mg L,发酵液经SPStreamline,SPSepharoseFF阳离子交换柱和SepharoseHeparinHiTrap柱纯化,产物纯度达到98%。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。

MITF基因扩增预测重组人血管内皮抑素联合达卡巴嗪一线治疗晚期黑色素瘤疗效的临床研究

目的探讨小眼畸形相关转录因子(MITF)基因扩增对重组人血管内皮抑素(恩度)联合达卡巴嗪一线治疗晚期黑色素瘤的疗效预测作用。方法收集60例接受恩度联合达卡巴嗪一线治疗晚期黑色素瘤患者的石蜡包埋组织样本,采用实时定量PCR检测MITF基因扩增,观察患者的疾病控制率和远期疗效。结果 56例晚期黑色素瘤样本成功检测,MITF基因扩增率为51.8%(29/56),其中肢端、非肢端皮肤、黏膜、原发不明黑色素瘤中的MITF基因扩增率分别为31.2%、63.2%、80.0%和36.4%(P=0.050)。MITF基因扩增组与无扩增组患者接受恩度联合达卡巴嗪治疗的疾病控制率分别为58.6%(17/29)和81.5%(22/27),差异无统计学意义(P=0.063);两组的中位无进展生存期分别为6.4个月(95%CI:0.5～12.2个月)和8.4个月(95%CI:6.8～10.3个月),差异亦无统计学意义(P=0.169)。结论中国晚期黑色素瘤患者MITF基因扩增率较高,检测MITF基因扩增可能有助于预测恩度联合达卡巴嗪治疗晚期黑色素瘤的疗效,总生存结果有待进一步随访。

人内皮生长抑素基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

目的 获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的人重组内皮生长抑素 (endostatin)蛋白 ,以研究其在治疗肿瘤及血管性疾病中的潜在应用价值。方法 从人的胎盘中分离总RNA经反转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,得到en dostatin的全基因 ,并将其与质粒pUCm T重组 ,测序证明获及的人内皮生长抑素基因的序列与先前报道一致后 ,用限制性内切酶将其切下与表达载体pET 1 1a重组 ,转化受体菌BL 2 1 (DE3)中 ,用IPTG诱导以包涵体形式表达 ,经层析纯化 ,鸡绒毛尿囊膜血管 (CAM)检测活性。结果 经SDS PAGE检测 ,重组人内皮生长抑素蛋白的分子量为2 0KD ,表达量约占蛋白总量的 40 %。纯化后的内皮生长抑素对鸡的绒毛尿囊膜血管的生长有明显的抑制作用。结论 得到了具有生物活性的重组人内皮生长抑素蛋白 。

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织凋亡相关基因表达的影响

目的:观察重组人内抑素(rh-end)对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织p53、fas和bcl-2基因表达的影响。方法:采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,定量检测该药对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织p53、fas和bcl-2 mRNA表达的影响。结果:与模型组相比,rh-end治疗组大鼠滑膜组织fas和bcl-2 mR- NA表达水平增加,p53 mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:rh-end可经fas介导诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡,且不依赖于p53,不能被bcl-2所抑制。

人内皮抑素cDNA克隆和初步表达

目的：克隆人内皮抑素基因， 获得初步表达产物，为进一步研究打下基础。方法：用RT-PCR方法从中国汉族人正常肝组织扩增出内皮抑素cDNA，T/A插入pUCm-T载体，测序，再插入表达载体 pKPL-3a，转化大肠杆菌 POP2136，42℃诱导表达，SDS-PAGE分析表达蛋白。结果：中国人内皮抑素cDNA开放阅读框架全长552bp，编码184个氨基酸， 其85位谷氨酸和98位天冬氨酸密码子的第三位碱基出现改变，但编码的氨基酸不变。结论：构建了中国人内皮抑素的克隆载体和表达载体，初步表达了约20kD人重组内皮抑素。

人内皮抑素基因的质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的 :将人内皮抑素 (endostatin)基因插入表达载体并进行原核表达。方法 :将 endostatin基因定向插入表达载体 p QE-31Bam H I/ Kpn I位点 ,构建重组质粒 p QEN,转化 E.coli M15 ,进行原核表达。结果 :在 IPTG的诱导下 ,endostatin基因在重组转化株 E.coli M15 (p QEN)中获得高效表达 ,SDS- PAGE显示表达产物分子量为 2 2× 10 3u,表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 34 .6 %。结论 :从组织中克隆

重组腺病毒rAdCDglyES的ES基因生物活性鉴定

目的:对构建的含融合自杀基因CDglyES的重组腺病毒中的ES基因是否具有独立的生物活性功能进行鉴定,为rAdCDglyES用于治疗恶性肿瘤奠定理论依据。方法:用重组腺病毒rAdCDglyES培养上清,在体外进行内皮细胞ECV-304生长抑制实验,同时做鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验,观察血管生成抑制。结果:重组腺病毒rAdCDg-lyES培养上清对内皮细胞ECV-304的生成有抑制作用(抑制率78.7%),而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏,平均血管数差异明显(P<0.01)。结论:构建的重组腺病毒rAdCDglyES表达产物具有独立的ES功能即抑制内皮细胞增殖,抑制新生血管形成的生物功能。

人内皮抑素基因治疗卵巢癌裸鼠移植瘤的研究

目的 探索人内皮抑素基因治疗人肿瘤的可行性。方法 将人卵巢癌 (SKOV3)瘤组织或其细胞移植于裸鼠皮下 ,建立成裸鼠移植瘤模型 ;用高保真PCR从含有人内皮抑素基因的重组质粒中扩增出与人生长激素信号肽序列融合的人内皮抑素编码区 ,将此基因克隆入pGEM_T载体中 ,经序列测定证明其序列的正确性 ;将此基因克隆入真核表达载体pcDNA3,经免疫荧光试验证明能在COS_1细胞中表达。结果 用重组质粒注射已形成移植瘤的裸鼠 ,能显著抑制移植瘤的生长 ;将基因注射与肿瘤移植同时进行 ,基因注射不仅能部分抑制移植瘤的形成 ,而且能抑制移植瘤的生长。结论 本研究构建的分泌型表达人内皮抑素的重组质粒可以用于肿瘤的基因治疗研究。

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用；对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系；作用24h后,观察到细胞凋亡现象；与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。

人内皮抑素转基因治疗裸鼠人大肠癌

目的 研究瘤内注射携带人内皮抑素 (hEN)基因的SA脂质体对裸鼠体内大肠癌LoVo细胞生长的抑制作用。方法 克隆、修饰hEN并构建真核表达质粒pcDNA3 hEN ,2 0 μg质粒加 40 μgSA脂质体构建SA pcDNA3hEN。 3 2只裸鼠背部皮下注射 2× 10 5/mlLoVo细胞悬液建立人大肠癌裸鼠模型。随机分 4组分别瘤内注射NS、SA、SA pcDNA3和SA pcDNA3hEN后 4、8、12、16d测量肿瘤体积。结果 SA pcDNA3hEN组肿瘤平均体积均小于对照组 ,第 12、16天的平均体积分别为 (0 .2 7± 0 .2 1)cm3 及 (0 .5 7± 0 .41)cm3 ,而对照组肿瘤体积为 :NS组 (0 .89± 0 .3 9)cm3及 (2 .5 0± 0 .91)cm3 ;SA组 :(0 .98± 0 .69)cm3 及 (1.98± 0 .5 9)cm3 ;SA pcDNA3组 :(0 .90± 0 .3 4)cm3 及 (1.88± 1.0 2 )cm3 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 瘤内注射携带hEN基因的SA脂质体可抑制裸鼠体内种植性人大肠癌的生长。

增殖型腺病毒介导的人内皮抑素基因治疗胰腺癌

目的 观察携带人内皮抑素基因的双重调控增殖型腺病毒（AdTPHre-hEndo）对胰腺癌的治疗作用.方法 通过病毒重组技术将人内皮抑素基因克隆入双重调控增殖型腺病毒基因组中,获得腺病毒滴度为3.25×10^10pfu/ml;通过建立SW-1990胰腺癌细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,分析基因转导后胰腺癌组织中内皮抑素的表达情况及对肿瘤血管的抑制作用.结果 构建了AdTPHre-hEndo;AdTPHre-hEndo组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著低于携带人内皮抑素基因的重组腺病毒（Ad-hEndo）组（P＜0.01）和选择性增殖型腺病毒（ONYX-015）组（P＜0.05）;AdTPHre-hEndo组内皮抑素表达量明显高于Ad-hEndo组和对照组（P＜0.01）.AdTPHre-hEndo组肿瘤微血管密度（MVD）为6.8±2.5,Ad-hEndo组和对照组MVD分别为16.0±4.6（P＜0.01）、47.2±10.0（P＜0.01）.结论 所构建的AdTPHre-hEndo可有效表达具有生物学活性的内皮抑素,使肿瘤内微血管生成减少,肿瘤细胞增殖减慢,具备应用于胰腺癌临床治疗的潜力.

放射联合重组人血管内皮抑制素致心肌纤维化的作用机制

目的建立实验动物模型探索放射性心肌纤维化的作用机制,验证重组人血管内皮抑制素可通过TGF-β1、Smad2、Smad3信号通路加重放射性心肌纤维化的过程.方法60只SD成年雄性大鼠随机分为25 Gy照射组、内皮抑制素6mg/kg组、内皮抑制素12 mg/kg组、25 Gy照射+内皮抑制素6mg/kg组、25Gy照射+内皮抑制素12 mg/kg组和对照组,分别在干预后1、3个月每组随机处死5只大鼠取心肌组织完成HE染色了解病理学改变,Masson染色了解纤维化程度,qPCR及Western Blot检测TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen-Ⅰ基因及蛋白表达.结果干预后3个月,25 Gy照射组、25 Gy照射+内皮抑制素(6、12mg/kg)组与对照组比较Masson染色见胶原沉积明显增加,TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen-Ⅰ蛋白及基因表达增加.结论给予大鼠总物理剂量为25Gy的照射,可诱导放射性心肌纤维化的发生.TGF-β1、Smad2信号通路是介导放射联合重组人血管内皮抑制素致心肌纤维化损伤的共同信号通路.