Modulating effects of survivin antisense oligonucleotide on changes of apoptosis and cell cycle of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

To investigate the modulating effects of survivn antisense oligonucletode (ASODN) on the cell cycle and apoptosis of human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line SMMC-7721 and explore its mechanism.Methods Survivin ASODN was transfected into SMMC-7721 cells mediated by DOTAP liposomal reagent.Electron microscopy,flow cytometry and RT-PCR were used to detect the changes in cell ultrastructure,apoptosis,cell cycle and the expression of cyclinB1 mRNA,respectively.Results After transfection of survivin ASODN,the expression of cyclinB1 mRNA in the cells significantly increased and increase in G2-M arrest and apoptosis appeared.Meanwhile,the cell ultrastructure had apoptotic changes such as chromatin condensation and apoptotic body formation.Conclusion Survivin ASODN can induce the expression of cyclinB1 that may result in G2-M arrest.Consequently,apoptosis is triggered.Survivin ASODN transfection might be an improtant new treatment for HCC.14 refs,2 figs,1 tab.

Inhibitory effect of metformin on the proliferation of human hepatoma HepG2 cells and its potential mechanism

Objective： This work aimed to study the inhibitory effect and the related mechanism of metformin （MET） on the proliferation of human hepatoma HepG2 cells. Methods： Human hepatoma HepG2 cells were treated with MET （0, 2, 10, and 50 mM）. The inhibitory effect of MET on the proliferation of HepG2 cells was determined by MTT method. The apoptosis of HepG2 cells was detected by flow cytornetry. The expression of cyclin D1 in HepG2 cells was examined by Western blot. ROS-DHE fluorescence probe was used to stain the reactive oxygen species （ROS） generated by HepG2 cells after treat- ment. Results： MET could inhibit the proliferation of HepG2 cells in a dose and time dependent manner. MET promoted the apoptosis of HepG2 cells. In addition, MET suppressed the expression of cell cycle protein cyclin D1 and induced the produc- tion of ROS in HepG2 cells. Conclusion： MET can inhibit the proliferation of human hepatoma HepG2 cells and induce cell apoptosis. Meanwhile, MET has the ability to decrease the expression of cyclin D1 and induce ROS generation, which may be involved in the mechanism of inhibiting hepatoma cells proliferation.

OA对人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402增殖的影响和对细胞凋亡的诱导作用研究

以人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402为研究对象,通过MTT法、细胞外部形态观察、Annexin V-FITC&PI双染法及TUNEL法等方法,研究了腹泻性贝毒的主要组分大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)对其增殖的影响及对细胞凋亡的诱导作用。结果表明:OA对人两株细胞的增殖均有显著的抑制作用,24 h IC50分别为65ng/mL和60 ng/mL,且这种抑制作用呈剂量依赖性。OA导致两株细胞的形态均发生明显变化:细胞变圆,脱壁,细胞膜形成泡状突起,最终形成膜包裹的凋亡小体。Annexin V-FITC和PI双染法及TUNEL法检测均发现:OA能够诱导两株细胞发生不同程度的凋亡,且凋亡细胞的比例与OA的浓度相关。以上结果表明:OA能够通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而对人肝细胞和肝癌细胞造成影响,且这种影响的程度与OA的浓度和作用时间密切相关。

黄芩素对人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移及侵袭的影响

目的:通过观察黄芩素对人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移侵袭能力及Ezrin、MMP-9、VEGF表达的影响,探讨黄芩素对人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移侵袭的作用及其可能机制。方法:体外培养SMMC-7721,经黄芩素干预后用划痕愈合实验和侵袭小室实验分别检测黄芩素对SMMC-7721细胞迁移运动能力和侵袭能力的影响;RT-PCR和免疫细胞化学法检测黄芩素作用于SMMC-7721细胞48h后对Ezrin、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表达的影响。结果:划痕愈合实验显示各浓度实验组划痕愈合宽度占原宽度的比例比对照组明显下降(P<0.05);体外侵袭实验显示实验组穿过人工基底膜胶的细胞数明显减少(P<0.05);实验组Ezrin、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.05)。结论:黄芩素可能通过直接或间接下调Ezrin、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白的表达而抑制人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移侵袭,传统中药黄芩可望为肝癌临床治疗提供新的安全、有效、价廉的治疗方法。

水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNA去甲基化作用研究

目的探讨水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNA甲基转移酶(DNMTs)表达的抑制作用。方法采用MTT法检测水蛭提取物对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用,根据回归方程计算出半数抑制浓度(IC50)。以1/2 IC50含药量的水蛭提取物处理肝癌HepG2细胞,并以5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-cdR)处理作阳性对照,处理72 h时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化等方法检测肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT13b mRNA及蛋白表达水平。结果肝癌HepG2细胞DNMT1呈高表达,DNMT3a、DNMT3b呈中低度表达。经水蛭提取物处理后肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a表达水平明显下降,DNMT3b基本不表达,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),与5-Aza-cdR组比较,水蛭提取物组降低DNMT1作用弱于5-Aza-cdR,降低DNMT3a、DNMT3b作用明显优于5-Aza-cdR组(P<0.05)。结论水蛭提取物能抑制肝癌HepG2细胞DNTMs表达,参与DNA去甲基化作用可能是水蛭抗肿瘤的机制之一。

载多西紫杉醇脂质微泡联合超声靶向微泡破裂对人肝癌细胞增殖和凋亡影响的初步研究

目的:初步研究载多西紫杉醇脂质微泡(docetaxel-loaded lipid microbubbles,LDLM)联合超声靶向微泡破裂(ultrasound targeted microbubbles destruction,UTMD)对人SMMC-7721肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外培养人SMMC-7721细胞,确定适宜的多西紫杉醇浓度,细胞分为6组,比较各组的细胞增殖抑制率、超微结构改变、凋亡率和细胞周期分布。结果:载药微泡+超声组的细胞增殖抑制率明显高于其他组,与其他各组相比差异有统计学意义(P=0.000);电镜下观察载药微泡+超声组的凋亡细胞最多;流式细胞仪检测结果显示载药微泡+超声组的细胞凋亡率最高(P=0.000),LDLM+US组G0/G1期细胞比例明显减少,为(0.79±0.27)%(P=0.000),G2/M期细胞比例升高最明显,为(90.54±0.48)%(P=0.000)。结论:LDLM联合UTMD可抑制人SMMC-7721细胞的增殖、促进其凋亡,为后续进一步从蛋白、基因层面探索其作用的机制奠定了重要基础。

hTRT反义基因转染对肝癌细胞端粒酶亚单位及细胞周期的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化活性亚单位 (Humantelomerasereversetranscriptase ,hTRT)反义基因转染对HepG2 肝癌细胞株端粒酶亚单位及细胞周期的影响。方法 采用流式细胞仪检测hTRT正义基因转染的HepG2 细胞(HepG2 S)以及hTRT反义基因转染的HepG2 细胞 (HepG2 AS)的细胞周期 ,采用RT PCR法检测上述细胞hTRT、端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白 1(TP1)以及c myc和bcl 2基因的变化 ,同时采用Westernblot检测hTRT蛋白质的变化。结果 HepG2 AS出现G0 G1 期阻滞 ,增殖指数增加 ,凋亡率亦明显增加 ,进一步研究发现 ,HepG2 AS端粒酶亚单位hTRT在蛋白质和mRNA水平均表达减少 ,而TP1、hTR无明显变化 ,bcl 2和c mycmRNA的表达亦明显下调。结论 hTRT反义基因不仅可以下调HepG2 细胞hTRTmRNA和蛋白质的表达 ,而且可以下调c myc、bcl 2mRNA的表达 ,从而一方面降低端粒酶活性 ,另一方面一定程度增加凋亡细胞的比率 。

环孢素A对阿霉素治疗肝癌影响的实验研究

目的探讨环孢素A（Cyclosporine A，CsA）对阿霉素（Adriamycin，ADM）治疗肝癌的影响。方法培养HepG2肝癌细胞，分成对照、CsA、ADM、CsA＋ADM组，分别处理24V～48h，采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡。结果肝癌细胞增殖能力48h明显受到抑制，CsA在5～1000μg／L随浓度增加，凋亡率逐渐增加，超过该浓度时，则出现凋亡率减低。CsA、及ADM均使G2期显著延长；CsA对HepG-2肝癌细胞有促进细胞凋亡作用．与ADM有协同促调亡作用。结论环孢素A对肝癌增殖有抑制作用，使G2期阻滞，促凋亡。环孢素A联合阿霉素对肝癌治疗有协同作用。

刺梨提取物抗肿瘤机制的研究

目的观察刺梨提取物(CL)的抗肿瘤作用并探讨其机制。方法采用艾氏腹水癌(EAC)小鼠模型观察CL的体内抗肿瘤作用。应用MTT法和绘制生长曲线了解CL的体外抗人肝癌SMMC-7721细胞作用。测定硝基四氮唑蓝还原能力、细胞培养上清液中甲胎蛋白含量,了解CL对肿瘤细胞的诱导分化作用。采用AO/EB荧光染色法、流式细胞仪检测法,分析CL对肿瘤细胞凋亡的影响。运用流式细胞仪检测CL对肿瘤细胞增殖周期的影响。结果CL能使EAC小鼠寿命延长、胸腺指数和脾指数明显增大。CL对SMMC-7721细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性,CL处理后的细胞生长曲线随着CL剂量的增加而逐渐下移。CL对SMMC-7721细胞的分化和凋亡具有一定的诱导作用,并使SMMC-7721细胞增殖阻止在G0/G1期。结论CL提高机体免疫功能可能是其体内抗肿瘤的机制之一;CL的体外抗SMMC-7721细胞机制与CL的细胞毒作用、诱导细胞分化、促肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖有关。

磁性三氧化二铁纳米粒子对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

应用 HepG2细胞作为研究对象,探讨 Fe_2O_3纳米粒子对肿瘤细胞的活力与凋亡的影响.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)还原检测法确定受试物的染毒剂量.分别对各个组进行流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化及凋亡.结果显示,Fe_2O_3纳米粒子在0.555～3.310 mg/mL 范围内均可抑制 HepG2细胞增值,IC_(50)为1.1lmg/mL.Fe_2O_3纳米粒子在0.173、0.347、0.694 mg/mL 剂量组均导致细胞线粒体膜电位均较对照组有所下降且细胞凋亡率显著增高.

胡桃醌不同给药途径对人肝癌细胞BEL-7402裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的采用裸鼠皮下移植瘤模型,通过不同给药途径对胡桃醌抗肿瘤活性和毒性进行评价。方法建立人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过腹腔注射和局部注射两个给药途径观察胡桃醌抑制肿瘤生长的效果。结果①以600、300和150μg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,发现该剂量胡桃醌对肿瘤生长没有明显的影响;NK细胞活性检测发现,600、300μg/kg胡桃醌对裸鼠免疫功能有影响(P均<0.01),150μg/kg胡桃醌则没有影响(P>0.05);与阳性对照组(5-Fu)相比,600μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异无显著性(P>0.05),300和150μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异有显著性(P<0.05,P<0.01),结果提示胡桃醌对小鼠免疫系统有一定的损伤作用。②以4.5、3和1.5 mg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,抑瘤率分别为为78.24%、66.57%、48.94%;4.5、3 mg/kg胡桃醌的抑瘤作用可与阳性对照组比拟(P均>0.05)。但4.5 mg/kg胡桃醌组裸鼠出现明显的皮下脂肪减少、消瘦,并有死亡现象。③以pH 7.4和pH 4.0的600、300和150μg/kg胡桃醌人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型局部给药,结果发现不同pH(pH 7.4或4.0)600、300μg/kg的胡桃醌局部注射抑瘤作用与阳性对照组(5-Fu)组差异无显著性(P>0.05),而不同pH的150μg/kg胡桃醌抑瘤作用不明显。同一浓度不同pH药物的抑瘤作用差异无显著性(P均>0.05),但pH 4.0的胡桃醌组肿瘤细胞肝转移较少。结论胡桃醌不同给药途径均可抑制人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,但有一定的毒副作用,药物安全范围较小。

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.

二甲双胍对人肝癌细胞 HepG2增殖及脂肪酸合酶的影响

目的二甲双胍治疗的糖尿病患者癌症发生风险较其他药物治疗者显著降低。探讨二甲双胍在人肝癌细胞HepG2中的抗肿瘤活性与脂肪酸合酶的关系。方法选取不同浓度(1、5、10、15 mmol/L)二甲双胍处理HepG2细胞24、48、72 h,用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响。同时设阳性对照(紫杉醇10μg/m L),阴性对照(二甲双胍0 mmol/L)。设0、5、10、15 mmol/L二甲双胍处理72 h,用Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、磷酸化AMPK(P-AMPK)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P-m TOR)、磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)蛋白表达,RT-PCR检测FASN mRNA的表达水平。结果 1、5、10、15 mmol/L二甲双胍干预24、48、72 h,分别随二甲双胍浓度与处理时间的增加,HepG2细胞的增殖抑制作用逐渐增强(P<0.05),且呈时间和浓度依赖性。其中10 mmol/L二甲双胍处理后增殖抑制率在72 h接近50%、15 mmol/L二甲双胍处理后增殖抑制率均>50%。0、5、10、15 mmol/L二甲双胍处理HepG2细胞72 h后,P-AMPK的蛋白表达随药物浓度增高而上调,P-m TOR、FASN的蛋白表达随药物浓度增高而下调,三者在10、15 mmol/L二甲双胍作用后的表达较阴性对照的差异均有统计学意义(P<0.05);而P-Akt蛋白表达在二甲双胍各浓度间差异无统计学意义(P>0.05)。FASN mRNA的表达随药物浓度增加呈下降趋势,5、10、15 mmol/L二甲双胍作用后表达量均较阴性对照显著下降(P<0.05)。结论二甲双胍的的抗肿瘤作用与其激活AMPK、抑制m TOR和FASN有关。二甲双胍虽然抑制了m TOR的活化,但没有造成Akt的反馈性激活。

抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响。方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况。结果:①HepG2细胞有hALR的表达。②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长。结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长。

乙型肝炎病毒和黄曲霉素协同作用诱发人肝细胞癌细胞株的建立

为了研究人乙型肝炎病毒 (HBV)和黄曲霉素 (AFB1)在肝癌发生过程中的作用 ,我们用HBV感染的人胚胎肝细胞移植至裸鼠背部皮下 ,以后每周皮下注射AFB1,在裸鼠体内成功地诱发了人肝细胞癌。选 3只裸鼠所形成的肿瘤组织 ,分别再接种裸鼠传代。在裸鼠体内传至 5代后 ,将瘤组织在体外培养、传代 ,建立了 3个肝癌细胞株 ,分别为CBH - 1a、CBH - 1b和CBH - 2。对 3个细胞株进行生物学特性分析发现 ,细胞生长迅速 ,接触抑制消失 ,细胞增殖核计数Ki6 7阳性细胞占 38 2 %。用EMA单抗检测证实为人来源细胞。核酸原位杂交显示 ,细胞中HBV-X和HBV-S基因阳性 ,PCR可扩增出X 基因 ,证明HBV基因已到瘤细胞中。 3个细胞株细胞再接种裸鼠皮下 ,可再生成肿瘤。此实验证明了HBV协同AFB1在人肝细胞癌发生过程中的病因作用。同时 。

青龙衣提取物对人肝癌细胞株抑制作用的实验研究

目的:通过青龙衣提取物对人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用,筛选出其抑瘤活性成分并探讨其机制。方法:青龙衣抑瘤活性成分胡桃醌与氟尿嘧啶、奥沙利铂、亚砷酸注射液分别作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,分别于24h、48h、72h收集细胞,采用MTT法比较胡桃醌与其他组药物的抑瘤率,借助电镜观察胡桃醌作用于人肝癌细胞株SMMC-7721后细胞微细结构的形态变化,于激光共聚焦显微镜下检测细胞内Ca2+浓度变化。结果:MTT结果显示胡桃醌抑瘤具有剂量依赖性;0.01mg/mL剂量24、48 hMTT结果显示胡桃醌的抑瘤强度高于亚砷酸注射液,与氟尿嘧啶相当,低于奥沙利铂;电镜结果显示肝癌细胞染色质凝聚,核固缩,游离核糖体减少,出现大溶酶体颗粒,线粒体数量增多形成髓样变,部分细胞坏死;激光共聚焦显微镜检测结果显示胡桃醌作用于肝癌细胞SMMC-7721后细胞内Ca2+浓度增加。结论:青龙衣提取物抑瘤活性成分为化合物胡桃醌;胡桃醌对人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用可能是直接杀伤肿瘤细胞。

必需脂肪酸对BEL-7402人肝癌细胞生长和甲胎蛋白分泌抑制的研究

本实验用放射免疫法研究了必需脂肪酸亚麻酸和亚油酸对BEL-7042人肝癌细胞甲胎蛋白(AFP)的分泌的影响,并观察它们对肝癌细胞生长的抑制作用.实验结果表明,42～50μg/ml亚麻酸能明显地抑制肝癌细胞AFP分泌(P<0.01),亚油酸则作用较弱,与对照相比无差异(P>0.05),我们对亚麻酸的抗癌作用的研究为癌症病人的保健和治疗提供实验依据.

Nrf2在不同肝癌细胞株中的表达及定位

目的:观察红系衍生的核因子2相关因子2(Nrf2)在肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)中的表达及分布情况。方法:应用流式细胞术测定Nrf2阳性细胞的比例,激光共聚焦观察Nrf2在3种细胞株中的定位情况,通过Westernblot测定Nrf2在不同细胞胞质及胞核中的表达差异。结果:流式细胞术测定Nrf2在HepG2、Hep3B和SMMC-77213种细胞中表达率分别为99.39%、99.94%和99.98%,激光共聚焦观察到Nrf2在3种肝癌细胞株胞质胞核中均有分布,但不同细胞的分布规律各不相同,Western blot结果显示:Nrf2在HepG2中以胞质分布为主,在Hep3B中胞质、胞核分布相当,在SMMC-7721中以胞核分布为主。结论:Nrf2在3种肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)中均有表达,且在胞质胞核中均有分布,但在不同细胞中的分布规律各不相同,为下一步探讨肝癌细胞耐药机制的相关研究奠定了基础。

绿茶提取物对人肝癌细胞株SMMC-7721体外凋亡的影响

从茶多酚中分离提纯表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)单体。体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,采用不同浓度的EGCG对其进行干预,用流式细胞仪检测其对肝癌细胞凋亡的影响;免疫细胞化学法和RT-PCR检测EGCG作用于SMMC-7721细胞后对Survivin、突变型P53 mRNA和蛋白表达的影响。结果显示在EGCG的作用下,SMMC-7721凋亡明显增加(P<0.05);Survivin和突变型P53蛋白和mRNA表达水平均下调(P<0.05)。表明EGCG可能通过下调人肝癌细胞株Survivin和突变型p53的表达,进而促进人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡,以达到抗癌作用。

人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术及二维电泳图谱的建立

目的:建立人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术。方法:利用两种不同的裂解液提取细胞蛋白,进行双向电泳,经PDQuest软件分析与比较后,挑选匹配良好的10个蛋白点,进行基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的鉴定。结果:建立了稳定的人肝癌细胞株QGY-7701的双向电泳图谱,裂解液Ⅱ比裂解液Ⅰ提取的蛋白质量多25%,2-DE胶上蛋白点数多32%,从10个候选蛋向中鉴定出9个有意义的蛋白(P<0.05)。结论:初步建立了人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质组学研究技术,为进一步开展药物蛋白质组学研究奠定基础。