INTRACELLULAR EXPRESSION OF MULTIMERIZED ANTISENSE TAR-CORE RNAS INHIBIT THE REPLICATION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1 IN HUMAN CD_4+T LYMPHOCYTES

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我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析

根据全国HIV分子流行病学研究发现,B'和C亚型HIV-1在我国发生了重组,并以优势株形式在我国广泛流行。为了探讨这种HIV-1B'/C重组毒株tat基因的变异与其表型之间的关系,利用pET表达系统在大肠杆菌中高效表达了三种不同基因变异类型的Tat蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白的26%,Westernblot显示较好的反应原性,并通过金属鏊合层析纯化了目的蛋白。荧光素酶活性检测表明:体外表达的Tat蛋白具有明显的生物学活性,可以反式激活HIVLTR引导的报告基因的表达;三种Tat蛋白在激活活性上的差异与流行现场检测的病毒载量的高低存在明显的对应关系,说明tat基因的变异可以引起病毒生物学特性的改变,进而影响病毒的流行特征。此结果为进一步研究我国HIV重组毒株的基因变异特征及变异规律奠定了基础。

Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究

目的为了寻找能够阻断HIV-1复制的方法,探索控制HIV-1蔓延的第二代基因治疗的新途径。方法采用自身引物一模板PCR得到了含有TAR核心序列(+11到+47)的多聚TAR-Core DNA同向串联体。结果所有这些抗性基因策略均能对病毒的复制产生较好的抑制作用。结论 TAT蛋白序列中氨基酸的替换使活性改变,与其三维结构的变化间有一定的相关性。

HIV-1 Tat蛋白激活AKT信号调节肝细胞脂肪代谢基因表达

目的 研究人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Tat蛋白在调节人肝细胞脂肪代谢基因表达中的作用。方法 根据人肝脏中调节脂质生成的转录因子固醇调节元件结合蛋白-1c(Serbp1c)和碳水化合物调节元件结合蛋白(ChREBP)及其下游基因(Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1)的cDNA碱基序列,设计并合成引物;培养人肝细胞株LO2,PI3K/AKT信号通路抑制剂PD98059预处理,Tat蛋白刺激细胞后,提取不同时间点的细胞总RNA,逆转录生成cDNA,应用定量PCR(q-PCR)检测人肝细胞中Srebp1c和ChREBP及其下游基因Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1mRNA转录水平。结果 Tat蛋白显著增强人肝细胞中Srebp1c和ChREBP及其下游基因Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1 mRNA表达水平,在刺激6h后达到峰值;而且PI3K/AKT信号通路抑制剂PD98059显著下调Tat诱导的Srebp1c和ChREBP及其下游基因Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1基因转录。结论 HIV Tat蛋白在人肝细胞中对脂质生成有促进作用,进而调节肝细胞脂肪代谢。

人免疫缺陷病毒1型TAT突变蛋白及反义TAT RNA对TAT反式激活作用的抑制

Ｔａｔ（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）是人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）基因组编码的反式激活因子，突变分析表明它含有几个重要的功能域。为寻找控制ＨＩＶ复制的途径，构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲ（－１５８－＋８０）为启动子的ＴａｔｃＤＮＡ全长反义表达质粒ｐＡＳ－Ｔａｔ，并用已经构建的以ＨＩＶＬＴＲ－１５８到＋８０为启动子，具有不同突变点的突变Ｔａｔ基因表达质粒，以荧光酶基因为报告基因，共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，结果发现无论是反义Ｔａｔ表达质粒还是突变Ｔａｔ表达质粒，在瞬时转染体系中均能不同程度地抑制Ｔａｔ的活性，其中以ｐＭ５（５２位Ａｒｇ由Ｌｅｕ替代）和反义ＴａｔＲＮＡ的抑制效果最好。结果说明。

人免疫缺陷病毒1型TAT蛋白点突变对其反式激活作用的影响

不同免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１，ＨＩＶ－２和ＳＩＶ）的Ｔａｔ均有３个高度保守的结构域：Ｃｙｓ富集域、核心域和碱性氨基酸富集域，用ＰＣＲ定点突变法在ＨＩＶ－１Ｔａｔ蛋白的这些区域引入单氨基酸或多氨基酸突变；构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲ－１５８到＋８Ｏ区域为启动子，含有不同突变点的突变Ｔａｔ基因表达质粒；以荧光酶基因为报告基因，瞬时共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞：分析不同氨基酸突变对Ｔａｔ的反式激活作用的影响。结果发现，突变后的Ｔａｔ蛋白的活性均极大地降低或丧失，表明这些序列内的氨基酸的确定性对Ｔａｔ的活性至关重要。

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。

重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

目的构建人类免疫缺陷病毒病毒tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat中扩增tat基因,利用HindⅢ和BamHⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecTag,获得正向插入克隆(pSecTat)和反向插入克隆(pSecTat-AS),经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上约300bp位置出现条带,与预期的324bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与GenBank中登记的HIV-1tat基因100%同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×103蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT表达量高于反向克隆质粒转染细胞(P<0.05)。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高(P<0.05)。结论成功构建HIV-1tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的Tat蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。

缺失半胱氨酸富集区的HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的高效表达及免疫原性分析

目的删除人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）HXB2株Tat罗白（长度101个氨基酸）的半胱氨酸富集区（22～37位氨基酸）以提高其在大肠杆菌中的表达量因子稳定性，并分析缺失半胱氨酸富集区后的Tat蛋白[Tat（ΔC）蛋白]免疫原性的改变。方法应用PCR方法对Tat基因的半胱氨酸富集区（64—111位核苷酸）进行缺失突变，获得其突变体序列[Tat（ΔC）DNA]，并构建其重组表达质粒pET-32a-Tat（ΔC）。相同的条件下将pET-32a-Tat（Δc）和pET-32a．Tat质粒转人大肠杆菌B121（DE3）中进行诱导表达及纯化。用pET-32a-Tat（ΔC）融合蛋白免疫家兔制备抗血清，ELISA和Western blot方法对抗血清进行免疫原性分析。结果pET-32a-Tat（ΔC）蛋白在大肠杆菌中的表达水平（7．12mg／m1）明显高于pET-32a-Tat蛋白（1．50mg／m1）；pET-32a-Tat蛋白在表达纯化后及25℃和4℃放置7d后均有明显二聚体的产生，而pET-32a-Tat（ΔC）蛋白则未形成二聚体；pET-32a-Tat（Δc）蛋白免疫家兔可诱导产生高滴度的抗体（1：320000），该抗体与Tat（Δc）蛋白、Tat蛋白（1—101AA）及化学合成Tat（1～86AA）蛋白均呈特异性反应。结论缺失HIV-1 Tat蛋白的半胱氨酸富集区可明显提高其原核表达水平和蛋白的稳定性并较好地保留其免疫原性，为HIV-1 Tat疫苗研究提供了一种新型免疫原。

Molecular dynamics simulation of site-directed mutagenesis of HIV-1 Tat trans-activator

The Cys-rich domain, core region and basic domain are highly conserved and very important to the trans-activation activity of HIV-1 Tat trans-activator. The three-dimensional structures of 6 mutants of HIV-1 Tat protein were constructed with the methods of molecular dynamics simulation. The variations of the structures of the mutants have been analyzed and the factors that led to abolishment of trans-activation activity have been discussed.

人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白N末端缺失突变体融合蛋白的表达及其免疫原性分析

本研究采用PCR方法从人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)HXB2株tat基因中扩增编码Tat蛋白N末端1-21位氨基酸缺失的突变体Tat22-101基因片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat22-101,经双酶切及测序验证后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达及Ni^(2+)-NTA柱亲和层析纯化。纯化后的突变体融合蛋白PET32a-Tat22-101经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,其相对分子质量约为26.9kD。该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测结果表明,pET32a-Tat22-101融合蛋白不仅较好地保留其免疫原性,而且能诱导产生高滴度的针对Tat N末端区之外的Tat其他功能区表位的抗体,为进一步研究Tat生物学功能和研制新型HIV Tat疫苗奠定试验基础。

我国云南省艾滋病病毒感染的长期不进展者人免疫缺陷病毒1型tat基因的序列分析

目的人类免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）ｔａｔ基因是该病毒的调控基因之一。本研究是探讨ｔａｔ基因变异是否影响ＨＩＶ－１感染者的病程进展。方法从云南ＨＩＶ流行区的２２例ＨＩＶ感染后临床进程不同的人抽取外周血，提取核酸，用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＨＩＶ－１的ｔａｔ基因，并进行了核酸序列测定和分析。结果２２个ＨＩＶ毒株中，有１１株来自长期不进展者，均为Ｂ亚型。另外１１株来自一般感染者的ＨＩＶ毒株，５株为Ｂ亚型，６株为Ｃ亚型。长期不进展者和ＨＩＶ－１Ｂ亚型一般感染者的ｔａｔ基因序列与国际Ｂ亚型共享序列比较，两组均在相同的固定的４个位点上氨基酸与共享序列不一致。在系统树分析中两组亦聚集在一起，未显示出分离。Ｃ亚型一般感染者的ｔａｔ基因序例组内变异小，在固定的６个位点上与国际Ｃ亚型共享序列不一致。结论长期不进展者与一般Ｂ亚型感染者的Ｔａｔ蛋白序例均未发现规律性差异。ＨＩＶ感染后的进展速率可能与ＨＩＶ－１ｔａｔ基因序例无明显关系。

Ⅰ型人免疫缺陷病毒调控蛋白顺式转录激活因子的功能及其与疾病的相关性

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),又称艾滋病,一直是全球范围内公共卫生关注的重大传染病之一。Ⅰ型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)是导致AIDS的病原体,即使目前广泛采用的高效抗逆转录病毒疗法(鸡尾酒疗法)可有效抑制HIV-1的感染和复制,感染者依然会罹患其他疾病,如HIV-1相关的神经认知紊乱症(HIV-associated neurocognitive disorder,HAND)。本文主要探讨HIV-1中重要的调控蛋白顺式转录激活因子(trans-activator of transcription,Tat)的功能,以及其与HIV-1复制及HAND的相关性,以明确研发靶向Tat蛋白的抗AIDS药物的重要性。