腺相关病毒介导人α1干扰素基因在淋巴细胞中表达的研究

为了探讨人α1干扰素基因和腺相关病毒重组体pWP8A -hIFNα1在淋巴细胞中表达的情况 ,将pWP8A-hIFNα1以磷酸钙转染法转入淋巴细胞 ,于转染后 2 4小时、48小时、72小时和 1周分别提取细胞总DNA、RNA和蛋白质 ;经PCR、Southernblot,逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)和酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测该重组体在淋巴细胞中表达人α1干扰素情况。结果显示 ,pWP8A -hIFNα1转染淋巴细胞后 2 4小时检测到细胞内含人α1干扰素mRNA和蛋白质 ,并持续表达 1周以上。

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。

STING、ZEB1在老年宫颈癌患者中的表达及与HPV感染的相关性

目的探讨干扰素基因刺激因子(STING)、E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)在老年宫颈癌(CCA)患者中的表达变化及与人乳头瘤病毒(HPV)感染的相关性。方法选取2021年1月至2022年9月于该院行病理检验的CCA患者62例为CCA组,宫颈上皮内瘤变(CIN)患者65例为CIN组,正常宫颈者63例为对照组,观察记录各组患者宫颈STING、ZEB1阳性表达率及高危HPV感染情况,并分析STING、ZEB1水平与CCA临床病理特征及高危HPV感染情况的相关性。结果CCA组STING、ZEB1阳性表达率高于CIN组及对照组,CIN组ZEB1水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CCA组HPV16、18检出率高于CIN组及对照组,CIN组HPV16、18检出率高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CCA患者浸润深度、国际妇产科联盟(FIGO)分期与STING、ZEB1阳性表达率有关(P<0.05),肿瘤分化程度、淋巴结转移与STING阳性表达率有关(P<0.05),CCA患者STING、ZEB1阳性表达率与HPV16、18感染率呈正相关(P<0.05)。结论CCA患者STING、ZEB1阳性表达较高其表达量与FIGO分期、宫颈癌浸润深度、HPV16、18感染有关。STING、ZEB1可能与HPV16、18共同作用于CCA的发生、发展。

基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。

宫颈癌患者人乳头瘤病毒感染情况及STING、ZEB1蛋白水平分析

目的分析宫颈癌患者人乳头瘤病毒(HPV)感染情况及癌灶组织内干扰素基因刺激因子(STING)、E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)表达情况,为该类患者的治疗提供参考。方法收集我院病理检验科2019年1月至2022年1月63例宫颈癌标本(宫颈癌组)、55例宫颈上皮内瘤变(CIN)标本(CIN组)及50例正常宫颈标本(正常组),采用免疫组化法检测各标本内STING及ZEB1表达情况,采用原位杂交法检测各标本内高危HPV感染情况,分析STING及ZEB1蛋白表达情况与宫颈癌病理特征及高危HPV感染之间的关系。结果宫颈癌组标本STING及ZEB1表达量均高于CIN组及正常组,CIN组标本ZEB1表达量高于正常组,差异均有统计学意义(均P<0.05);CIN组标本STING表达量与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。宫颈癌组标本HPV16、18检出率高于CIN组及正常组,CIN组标本HPV16、18检出率高于正常组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。宫颈癌患者FIGO分期及浸润深度与其组织内STING及ZEB1蛋白阳性情况均存在相关性;此外,宫颈癌淋巴结转移及肿瘤分化程度与组织内STING蛋白阳性情况存在相关性,差异均有统计学意义(均P<0.05)。宫颈癌患者STING及ZEB1蛋白表达与其HPV16、18检出率间均呈正相关(均P<0.05)。结论宫颈癌组标本STING及ZEB1蛋白表达量均高于正常组及CIN组,且其表达量还与宫颈癌浸润、FIGO分期相关。STING和ZEB1可能与HPV16、18感染共同参与宫颈癌的发生及进展。

高危型HPV感染宫颈病变患者外周血cGAS/ STING/TBK1信号通路基因表达

目的 探究高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染宫颈病变患者外周血环鸟嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸合成酶/干扰素激活蛋白/TANK结合激酶1(cGAS/STING/TBK1)信号通路基因相对表达量。方法 选取2015年4月-2021年4月中部战区总医院妇产科收治的高危型HPV感染宫颈病变患者89例为研究组,同期无HPV感染的宫颈病变患者89例为对照组,采用第2代杂交捕获实验检测高危型HPV DNA载量,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测外周血cGAS、STING和TBK1 mRNA表达水平。结果 研究组外周血单个核细胞中cGAS、STING和TBK1 mRNA水平高于对照组(P<0.05);不同高危型HPV DNA载量患者外周血cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达的比较差异有统计学意义(P<0.05),其中高载量组cGAS、STING和TBK1 mRNA水平最高,低载量组最低(P<0.05);不同高危型HPV感染类型患者外周血cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达的比较差异无统计学意义。结论 高危型HPV感染对宫颈病变患者外周血cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达影响较大,高危型HPV DNA载量与其表达水平密切相关。

cGAS识别HTLV-1反转中间体并诱导STING依赖性的固有免疫应答

目的探讨DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)在成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染过程中对病毒反转中间体的识别以及诱导的下游信号通路。方法将生物素标记的HTLV-1的反转中间体ssDNA90转染入HeLa细胞,采用免疫共沉淀试验检测cGAS与ssDNA90的相互作用;将HeLa细胞与HTLV-1阳性细胞系MT2共培养,采用免疫共沉淀的方法检测cGAS与干扰素基因刺激蛋白(STING)的相互作用;采用siRNA的方法在HeLa细胞中敲减STING,24 h后再转染入cGAS表达质粒,24 h后与MT2细胞共培养24 h,real-time PCR实验检测HeLa细胞中干扰素(IFN)-β、调节活化正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、HTLV-1病毒蛋白Tax、p19以及HBZ的表达,免疫印迹检测HeLa细胞中干扰素调节因子3(IRF3)和p65的磷酸化水平。结果cGAS与ssDNA90存在相互作用;cGAS与STING存在相互作用,且作用部位在胞质中;在敲减STING的HeLa细胞中,cGAS过表达对IFN-β、RANTES和TNF-α的表达量无明显影响,对HTLV-1病毒蛋白Tax、p19和HBZ的表达量无明显影响,对IRF3和p65的磷酸化水平无明显影响。结论cGAS可结合HTLV-1的反转中间体ssDNA90并通过STING激活固有免疫应答。

人类免疫缺陷病毒-1vpr基因干扰RNA载体构建及筛选的体外研究

目的筛选鉴定针对HIV-1vpr基因的小干扰RNA（siRNA）干扰片段，探讨siRNA对HIV-1vpr基因的干扰效率。方法根据siRNA设计要求合成针对HIV-1vpr靶点的2段寡核苷酸片段，并构建相应载体，转染含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞。设2个实验组（siRNA56、siRNA160组），1个阴性对照组（NC组），空白HEK293T细胞为对照组（Con组）。各组分别进行总RNA、蛋白提取，实时PCR和蛋白质印迹分别从核酸和蛋白水平验证有效的靶向HIV-1vpr的siRNA片段。ELISA检测各组培养细胞上清液中IL-17、丫干扰素水平。结果DNA测序结果表明成功构建了哺乳动物细胞pRNAT—U6．1／Neo—Vpr-56／160（siRNA56和s．RNA160）表达载体。siRNA56和siRNAl60干扰使HIV1vpr基因在mRNA水平的表达分别下降69．0％和76．1％；在蛋白表达水平分别下降76．3％和86．5％。Con组、NC组、siRNA56组和siRNA160组细胞培养上清液中IL-17分别为（1．936±0．415）、（1．815±0．393）、（1．935±0．356）和（2．03±0．421）pg／mL；了干扰素分别为（1．673±0．234）、（1．648±0．332）、（2．169±0．362）和（2．301±0．4125）pg／mL。结论表达pRNAT—U6．1／Neo—vpr-56／160（sirNA56和siRNA160）的质粒构建成功，针对不同基因片段的siRNA均可以下调HIV-1vpr的表达水平。

HIV感染合并肺部感染患者 CD3+CD4+-T细胞表达的研究

目的探讨α干扰素(Interferon-α,IFN-α)、干扰素诱导基因56(Interferon-stimulated gene 56,ISG56)、粘病毒抵抗蛋白A(Myxovirus resistance protein A,MxA)、免疫调控受体程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)和T细胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸样抑制基序(T cell immunoglobulin and ITIM domain,TIGIT)对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)合并肺部感染患者CD3^+CD4^+-T细胞表达的影响。方法选取2016年12月-2017年12月于余姚市市人民医院就诊的52例HIV合并肺部感染患者作为研究组进行研究,另选择同期48例HIV未合并肺部感染患者作为对照组,检测患者外周血CD3^+CD4^+-T细胞表面的IFN-α、ISG56、MxA、PD-1和TIGIT指标水平情况。结果研究组CD3^+CD4^+-T细胞比例高于对照组(P<0.05);研究组IFN-α、ISG56、MxA分别为(15.82±5.31)、(0.74±0.22)、(0.83±0.14)pg/ml低于对照组(P<0.001);研究组TIGIT和PD-1的CD3^+CD4^+-T细胞分别为(23.61±12.83)%、(51.32±13.74)%高于对照组(P<0.05);研究组TIGIT CD3^+CD4^+-T细胞表面百分数与CD4+-T细胞绝对数呈负相关(P=0.027);与病毒载量呈正相关(P=0.001);研究组PD-1CD3^+CD4^+-T细胞表面百分数与CD4+-T细胞绝对数呈负相关(P=0.026);与病毒载量无相关性(P=0.711)。结论HIV合并肺部感染患者,CD3^+CD4^+-T细胞占比上升,IFN-α、ISG56、MxA降低,TIGIT和PD-1升高,相关指标变化证明当受到感染时机体免疫功能会发生紊乱,且与HIV疾病进展具有一定程度的相关性,具有一定的临床价值。