1-硝基芘通过线粒体损伤致卵巢颗粒细胞功能障碍

目的探讨1-硝基芘(1-nitropyrene,1-NP)通过诱导线粒体损伤对人卵巢颗粒细胞KGN的增殖、周期进展及性激素合成的影响。方法采用不同浓度(0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L)1-NP染毒KGN细胞48 h,EdU掺入法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA检测细胞培养上清中雌二醇及孕烯醇酮浓度,DCFH-DA探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,MitoSOX探针检测线粒体超氧化物(mitochondrial superoxides,MitoSOX)水平,JC-1探针检测线粒体膜电位,ATP试剂盒检测细胞内ATP含量,Western blot检测细胞增殖、周期进展、DNA损伤反应以及性激素合成相关蛋白的表达。采用线粒体抗氧化剂IDE、1-NP单独和联合处理细胞,再次检测上述指标。结果不同浓度1-NP染毒后KGN细胞增殖显著降低(P<0.05)。2.5、5、10μmol/L的1-NP处理细胞后,细胞增殖标志物PCNA蛋白表达显著降低,5、10μmol/L的1-NP处理后G2/M期细胞比例显著升高(P<0.05)。1-NP(10μmol/L)处理3 h即可诱导γ-H2AX表达增加(P<0.01);不同浓度1-NP处理后,DNA损伤反应通路蛋白p-ATM、p53和p21cip1表达明显升高(P<0.05),G2/M期阻滞相关蛋白CDK-1和CyclinB1表达明显降低(P<0.05)。此外,1-NP处理后KGN细胞的雌二醇、孕烯醇酮浓度显著下降(P<0.05),性激素合成相关蛋白CYP19、CYP11A1的表达也受到抑制(P<0.05)。线粒体及氧化应激相关指标检测结果显示,1-NP导致KGN细胞中ROS、MitoSOX水平显著升高,线粒体膜电位和ATP水平呈剂量依赖性下降。与10μmol/L 1-NP单独染毒组相比,IDE与1-NP联合处理组G2/M期细胞比例显著下降,雌二醇、孕烯醇酮水平出现一定程度升高,DNA损伤反应、细胞周期进展以及性激素合成相关蛋白的表达也出现明显恢复。同时,IDE与1-NP联合处理显著改善1-NP诱导的线粒体损伤,包括降低细胞ROS和MitoSOX水平,提高线粒体膜电位和ATP水平。结论1-NP可诱导线粒体损伤,造成卵巢颗粒细胞KGN的增殖抑制、周期阻滞、性激素合成障碍,而提高线粒体功能则能部分缓解1-NP诱导的KGN细胞功能障碍。

棕榈酸对人卵巢颗粒细胞脂质代谢和自噬的影响

目的探讨棕榈酸对人卵巢颗粒细胞KGN细胞株自噬和脂质代谢的影响及其机制。方法以不同浓度棕榈酸单独或联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理刺激KGN细胞,油红O染色实验检测细胞脂质沉积;细胞增殖试剂盒(CCK-8)法测定KGN细胞的活性;DCFH-DA荧光探针标记法检测细胞活性氧(ROS)含量;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)表达水平、微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)、泛素结合蛋白p62、PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)、Parkin表达水平。结果在0~400μmol·L^(-1)范围内,随着棕榈酸浓度上升,细胞内脂滴数量增多,SREBP1表达量增加,细胞活性显著下降(P<0.05)。与对照组比较,400μmol·L^(-1)棕榈酸处理组细胞内ROS含量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高(P<0.05),p62、PINK1、Parkin蛋白相对表达量上调(P<0.05)。使用自噬抑制剂3-MA预处理后,3-MA+棕榈酸处理组较400μmol·L^(-1)棕榈酸处理组细胞活性升高(P<0.05),ROS含量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P<0.05),p62、PINK1、Parkin蛋白相对表达量降低(P<0.05)。结论棕榈酸对卵巢颗粒细胞具有脂毒性,可能通过PINK1/Parkin途经激活卵巢颗粒细胞自噬,并可被3-MA逆转。

美洲大蠊小肽预处理对H_(2)O_(2)诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激及凋亡的抑制作用

目的探讨不同浓度美洲大蠊小肽预处理对H_(2)O_(2)诱导人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)氧化应激及凋亡的影响。方法取对数生长期的KGN细胞,分为空白组、H_(2)O_(2)组和美洲大蠊小肽50、100、150组。各组均常规培养24 h,空白组不予特殊处理,H_(2)O_(2)组加入250μmol/L H_(2)O_(2)作用6 h;美洲大蠊小肽50、100、150组分别加入50、100、150μg/mL美洲大蠊小肽进行预处理,然后加入250μmol/L H_(2)O_(2)作用6 h。采用CCK-8法检测空白组、H_(2)O_(2)组和美洲大蠊小肽50、100、150组分别预处理6、12、24 h的细胞存活率,并比较各组(美洲大蠊小肽50、100、150组均预处理12 h)细胞活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)表达。结果H_(2)O_(2)组细胞存活率低于空白组(P<0.05)。预处理6 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率与H_(2)O_(2)组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率均高于H_(2)O_(2)组(P均<0.05)。与预处理6 h比较,美洲大蠊小肽50、100、150组预处理12、24 h的细胞存活率均升高(P均<0.05);预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较,H_(2)O_(2)组细胞MDA、NO、ROS表达均升高(P均<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,美洲大蠊小肽50、100、150组细胞MDA、NO、ROS表达均降低(P均<0.05),美洲大蠊小肽50、100、150组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论美洲大蠊小肽预处理能够减轻H_(2)O_(2)诱导的KGN细胞氧化应激及凋亡,以50μg/mL作用12 h为最佳预处理条件。

人卵巢颗粒细胞的体外培养方法探讨

目的建立人卵巢颗粒细胞分离纯化、体外培养的有效方法。方法收集体外受精—胚胎移植(IVF-ET)穿卵时的卵泡液,用胰蛋白酶消化法及密度梯度离心法分离纯化颗粒细胞并用不同培养基进行培养。结果用体积分数为50%的Percoll细胞分离液分离,DMEM/F12或McCoy’5a液体培养基进行培养,细胞纯度高,存活率高,后续生长良好。结论建立了人卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究奠定良好的基础。

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达。方法采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞。通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达。结果(1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Westernblotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达。结论成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础。

GSK-3β抑制剂对体外培养多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞睾酮分泌过多的影响

目的探讨糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂SB216763改善多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞睾酮(T)分泌异常的作用机制。方法将行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的20例不孕妇女按发病原因分为三组,其中不孕原因为输卵管及男方因素的非PCOS患者8例为对照组,PCOS不孕患者12例平均分为PCOS组和GSK-3β抑制剂组,每组6例。对照组及PCOS组患者的卵巢颗粒细胞进行体外培养48 h,利用放射免疫法检测细胞上清液中的雌二醇(E2)、孕酮(P)、T的水平。GSK-3β抑制剂组用浓度为5、10、25、50、100μmol/L的GSK-3β抑制剂SB216763对体外培养的PCOS患者卵巢颗粒细胞进行干预,后继续培养48 h,检测细胞上清液中的E2、P、T的水平。结果 (1)PCOS组与对照组患者相比其卵巢颗粒细胞中T分泌明显升高(P<0.01),而P和E2的表达变化不大(P>0.05)。(2)GSK-3β抑制剂组PCOS患者卵巢颗粒细胞给予不同浓度的GSK-3β抑制剂SB216763作用后,与PCOS组相比,T平明显下降(P<0.05)。(3)GSK-3β抑制剂SB216763浓度为5μmol/L时对PCOS患者卵巢颗粒细胞T分泌的抑制作用最明显(P<0.01)。结论 PCOS患者卵巢颗粒细胞T分泌异常增高,GSK-3β抑制剂SB216763能够抑制其T的过多分泌。

不同分离方法对人卵巢颗粒细胞体外培养的影响

目的比较人卵巢颗粒细胞不同分离方法。方法取体外受精-胚胎移植(IVF-ET)采卵时的卵泡液,用裂解法、密度梯度离心法、酶解法分离纯化并原代培养人卵巢颗粒细胞。比较不同的分离方法获得的卵巢颗粒细胞数量、形态及其对早期培养的影响。结果裂解法得到的颗粒细胞数较密度梯度离心法、酶解法多(P<0.005,P<0.001);比较3种分离方法获得的卵巢颗粒细胞的活性和孕激素分泌量差异无统计学意义;接种24 h后,酶解法得到的卵巢颗粒细胞存活量最多(P<0.05),裂解法得到的存活细胞最少(P<0.05);裂解法获得的卵巢颗粒细胞继续培养48、72及96 h均较培养24 h有明显细胞增殖(P<0.05),且与其他组存活的细胞量差异无统计学意义。结论裂解法得到的颗粒细胞数量多,细胞生长较好,操作简单,是较理想的分离人卵巢颗粒细胞的方法。

人卵巢颗粒细胞的体外分离培养方法改进

目的建立高效稳定的人卵巢颗粒细胞的体外分离培养方法。方法收集体外受精-胚胎移植取卵时的卵泡液,查阅近几年文献中人卵巢颗粒细胞的分离纯化方法,对沉淀法和梯度密度离心法进行改进,用改进了的沉淀法和密度梯度离心法相结合对卵巢颗粒细胞进行分离纯化,选择合适的消化时间,简化分离纯化步骤从而减少对颗粒细胞的损伤。结果分离出的人卵巢颗粒细胞生长状态良好,存活率高,收获的细胞数量多,后续生长稳定。结论建立了人卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究奠定良好的基础。

人卵巢颗粒细胞体外分离培养后连续传代的观察

目的观察两种方法分离的人卵巢颗粒细胞(GCs)体外培养后的连续传代情况。方法选取行辅助生殖技术治疗的不孕患者,收集促排卵后穿刺取卵获得的卵泡液(FF),分别用密度梯度离心法和红细胞裂解法分离人GCs,进行体外培养、扩增及连续传代,并用免疫荧光法对原代及传代后GCs进行鉴定。结果红细胞裂解法获得的GCs数量较密度梯度离心法显著增多(P<0.05),密度梯度离心法分离的GCs的24 h贴壁率显著高于红细胞裂解法(P<0.05)。两种方法分离的GCs均在7 d出现短梭形改变,10 d左右开始退化。两种方法分离的原代GCs在第3~5天为快速增殖期,第7天细胞增殖达到顶峰,第10天左右细胞量下降,每个时间点密度梯度离心法处理的细胞量均显著高于红细胞裂解法(P<0.05);传代后细胞1~5 d为快速增殖期,7 d左右达顶峰,10 d左右下降,各时间点两种分离方法所获GCs传代培养的细胞量均无统计学差异(P>0.05)。两种方法分离的GCs均可进行连续传代,细胞形态无明显差异,且连续传代后的GCs仍表达卵泡刺激素受体(FSHR)。结论密度梯度离心法较红细胞裂解法可获得生长情况更为良好的原代GCs;两种分离方法所获GCs均可体外连续传代。

棕榈酸经过氧化物酶体增殖物激活受体α影响KGN细胞SR-BI的表达和脂质含量

目的探讨棕榈酸经过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)对卵巢颗粒细胞脂质含量的影响。方法采用不同浓度的棕榈酸(PA)处理人卵巢颗粒细胞株(KGN)。经油红O和NBD-Cholesterol方法观察KGN细胞内脂质含量,Western blot、免疫细胞化学和免疫荧光检测B类I型清道夫受体(SR-BI)、PPARα的表达。结果不同浓度棕榈酸(0、0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L)呈浓度依赖性促进KGN细胞脂质增加。不同浓度棕榈酸(0、0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L)呈浓度依赖性上调KGN细胞SR-BI的表达(P <0.05)。不同浓度棕榈酸(0、0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L)呈浓度依赖性上调KGN细胞PPARα的表达(P <0.05)。结论棕榈酸可促进颗粒细胞脂质含量增加,其机制推测与SR-BI、PPARα表达上调相关。

人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的建立

目的:建立人促卵泡激素(FSH)体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证。方法:以人卵巢颗粒细胞KGN为基质细胞,用不同浓度的FSH与KGN细胞表面的FSH受体结合,刺激细胞产生不同浓度的孕酮,通过测定细胞培养上清中的孕酮含量来评价FSH的生物学活性,结果用国际标准品进行校正;对方法的专属性、线性与范围、回收率、精密度、耐用性进行验证;对市售FSH产品进行检测,并与传统动物体内活性检测结果进行比较。结果:KGN细胞对FSH有很好的剂量反应关系,方法专属性符合要求;线性范围为0.1~200 ng/m L,相关系数R2≥0.99;回收率为80%~120%;经3次重复测定,3批市售样品和3批自制样品的活性分别为(13.4±0.4)^(13.5±0.8)和(12.9±0.7)^(14.3±1.2)IU/μg,变异系数在15%之内;结果显示该方法有很好的耐用性。测定3批市售重组人FSH产品和1批尿源FSH国家标准品,其体外活性测定结果与传统动物体内活性测定结果一致。结论:建立并验证了一种利用KGN细胞体外测定FSH生物学活性的方法,有望代替传统的动物体内活性测定方法,可用于FSH的生物学活性评价和质量控制。

CuInS_(2)/ZnS量子点对人卵颗粒细胞的毒性效应与机制

目的:体外原代培养人卵颗粒细胞,检测CuInS_(2)/ZnS量子点的细胞毒性效应并分析其分子机制。方法:采用透明质酸酶消化收集人超排卵外的颗粒细胞,进行体外原代培养,设立PBS对照组和低(1μg/mL)、中(10μg/mL)、高(100μg/mL)CuInS_(2)/ZnS量子点实验组,利用CCK-8法检测量子点处理后颗粒细胞活力的变化并计算半数抑制浓度(IC_(50));采用Annexin V/PI双染色法流式细胞术检测颗粒细胞凋亡情况;采用不同试剂盒分别检测性激素孕酮(P)和雌二醇(E2)的释放以及氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及谷胱甘肽还原酶(GSH)活性的变化。结果:体外原代培养人卵颗粒细胞生长良好,在体外培养72 h后开始自发凋亡并黄素化。采用CuInS_(2)/ZnS量子点处理后48 h的IC;为66.72μg/mL。与PBS对照组比较,高剂量量子点处理组明显抑制细胞活力(P<0.01),诱导细胞凋亡(P<0.01),增加颗粒细胞P和E2的释放(P<0.05或P<0.01),中、高剂量量子点处理后颗粒细胞中ROS水平显著增加(P<0.05或P<0.01),颗粒细胞内的MDA、T-AOC及T-SOD活性均显著降低(P<0.01),高剂量量子点作用后细胞内的GSH活性显著升高(P<0.01)。结论:本研究成功进行了人卵颗粒细胞系的体外原代培养,发现10μg/mL剂量以上CuInS_(2)/ZnS量子点可以通过侵入颗粒细胞引起氧化损伤,促进细胞凋亡引发毒性效应,为CuInS_(2)/ZnS量子点在临床应用中的生物安全性评估提供了有价值的信息。

二甲双胍对IFN-γ诱导的人卵巢颗粒细胞损伤的保护作用

目的:探讨二甲双胍对干扰素(interferon,IFN)-γ诱导的人卵巢颗粒细胞KGN功能损伤的效应及可能机制。方法:采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍单独及与IFN-γ共处理对KGN细胞活力的影响,并观察细胞生长状态的变化;流式细胞术检测不同处理对KGN细胞凋亡及周期的影响;q-PCR法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)mRNA的表达。结果:IFN-γ可抑制KGN细胞活力、阻滞细胞从G0-G1期进入S期,并促进凋亡(P <0.05);二甲双胍单独处理几乎不影响KGN细胞功能;但二甲双胍与IFN-γ共同作用可提高损伤的KGN细胞活力,缓解IFN-γ引起的细胞凋亡及周期阻滞,并抑制细胞周期负性调节蛋白CDKN1A表达的异常上调。结论:二甲双胍可减轻IFN-γ诱导的KGN细胞功能损伤,并且可能是通过下调细胞周期负性调节蛋白CDKN1A的异常表达发挥保护作用。

胰岛素样生长因子2通过磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路调控人卵巢颗粒细胞增殖的机制

目的检测胰岛素样生长因子2(IGF2)对人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)增殖的调控作用及作用机制。方法将体外培养的KGN细胞,分不同浓度IGF2处理组(对照组和25μg/L、50μg/L、100μg/L IGF2组)和磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路干预组(以LY294002干预处理将细胞分对照组、100μg/L IGF2组、LY294002组和IGF2+LY294002组)。采用MTS和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(Ed U)法检测IGF2对KGN细胞增殖的影响,ELISA法检测细胞培养液上清中雌激素、孕激素的含量,Western blotting法检测各组胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)及CYP19A1蛋白表达。结果随着IGF2的浓度梯度增高,KGN细胞的增殖率及雌激素、孕激素的分泌量逐渐升高,以100μg/L IGF2处理组的细胞增殖率和激素水平最高(P<0.01),而抑制PI3K/Akt信号通路,细胞增殖率和激素的分泌量均明显降低(P<0.01);Western blotting结果显示,IGF1R、p-Akt及CYP19A1蛋白表达水平随着IGF2的浓度梯度逐渐升高(P<0.05),而干预PI3K/Akt信号通路可影响上述蛋白的表达,与对照组相比,IGF2组和IGF2+LY294002组IGF1R及p-Akt蛋白表达均明显升高(P<0.01),CYP19A1在IGF2组明显升高(P<0.01),LY294002组p-Akt及CYP19A1蛋白明显降低(P<0.05),IGF1R的表达差异无统计学意义。与IGF2组相比,IGF2+LY294002组p-Akt及CYP19A1蛋白表达降低(P<0.01),IGF1R的表达差异无统计学意义,LY294002组p-Akt及CYP19A1蛋白表达量均显著降低(P<0.01)。结论IGF2可能由IGF1R介导通过PI3K/Akt信号通路促进人卵巢颗粒细胞的增殖及分泌功能。

下调miR-301a-3p抑制人卵巢颗粒KGN细胞增殖和诱导凋亡的机制研究

目的探讨miR-301a-3p对人卵巢颗粒KGN细胞增殖和凋亡的机制研究。方法采用RT-qPCR检测38例多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢皮质组织和外周血、人卵巢颗粒KGN细胞内miR-301a-3p表达水平;将KGN细胞分为空白对照、anti-miR-NC、anti-miR-301a-3p,RT-qPCR检测miR-301a-3p表达水平;MTT、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡;平板实验检测克隆形成能力;Western blot检测PCNA、Bax、Bcl-2及MAPK信号通路相关蛋白表达。加入MAPK信号通路抑制剂SB203580,并采用以上方法检测其增殖和凋亡的影响。两组间比较采用独立样本t检验,方差不齐性采用t'检验;多组间比较采用单因素方差分析,两两比较组间方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Tamhane's T2检验。结果与对照组比较,PCOS组的组织内和外周血内miR-301a-3p表达(2.65±0.44比1.08±0.22,2.54±0.47比1.05±0.22)升高(P均<0.05);与人正常卵巢上皮IOSE80a细胞比较,人卵巢颗粒KGN细胞内miR-301a-3p表达(2.38±0.38比0.99±0.10)升高,差异有统计学意义;下调miR-301a-3p可降低细胞活性、克隆细胞数,增加细胞凋亡率、Bax蛋白表达,降低PCNA、Bcl-2、p-p38 MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平,差异有统计学意义(P均<0.05)。与anti-miR-301a-3p比较,anti-miR-301a-3p+SB203580克隆细胞数、细胞活性降低,PCNA、Bcl-2蛋白表达水平降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论在人卵巢颗粒细胞内miR-301a-3p高表达,下调miR-301a-3p可抑制人卵巢颗粒KGN细胞增殖和诱导凋亡,其作用机制可能与抑制MAPK信号通路有关。

c-fos和CYP17对多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞雄激素分泌过多的影响及机制

为研究多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞中c-fos及CYP17基因表达的变化,探讨c-fos及CYP17基因对PCOS卵巢颗粒细胞雄激素分泌的影响及可能的作用机制,对拟行IVF/ICSI-ET的PCOS患者及非PCOS患者分为对照组(非PCOS患者)和PCOS组(PCOS患者),两组患者的卵巢颗粒细胞进行体外培养48 h,利用放射免疫法检测细胞上清液中的雌二醇(E_2)、孕酮(P)、睾酮(T)的水平;利用2-NBDG标记葡萄糖检测颗粒细胞的葡萄糖摄取能力;采用免疫蛋白印迹(Western Blot)法分别评估颗粒细胞中c-fos及CYP17基因的表达变化。结果发现,PCOS组患者与对照组患者相比,颗粒细胞培养上清液中睾酮水平升高(P<0.05)、孕酮水平降低(P<0.05)、雌二醇水平无明显变化(P>0.05),且颗粒细胞对2-NBDG标记葡萄糖摄取明显降低(P<0.05),提示PCOS患者卵巢颗粒细胞雄激素分泌异常增高,并存在糖代谢异常。与对照组患者相比,PCOS组患者颗粒细胞CYP17基因表达升高(P<0.05),c-fos基因表达降低(P<0.05),提示颗粒细胞c-fos基因异常低表达,可能降低了对CYP17基因的抑制作用,使CYP17高表达,可能是卵巢颗粒细胞雄激素分泌增加的原因之一。

PPARγ和RXR激动剂抑制人卵巢颗粒细胞芳香化酶活性和其mRNA的水平

目的 探讨过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和维甲类X受体 (RXR)激动剂对人卵巢颗粒细胞芳香化酶活性的调节作用。方法 测定人卵巢颗粒细胞 (KGN)在PPARγ激动剂曲格列酮、吡格列酮和前列腺素J2 以及RXR激动剂LG10 0 2 68处理前后芳香化酶活性、雌酮 (E1)的变化以及P45 0芳香化酶 (P45 0arom)mRNA的表达水平。对P45 0arom启动子Ⅱ进行分析 ,以确定PPARγ和RXR是否直接抑制P45 0arommRNA的转录。结果 (1)PPARγ激动剂和RXR激动剂均能显著抑制芳香化酶活性 ,两者结合使用抑制作用进一步增强并且使E1的生成减少 ;(2 )芳香化酶活性的降低与P45 0arommRNA水平下降有关 ;(3 )PPARγ和RXR激动剂对 1.0kb长的P45 0arom启动子Ⅱ控制的荧光素酶蛋白无调节作用。结论 PPARγ和RXR激动剂对人卵巢颗粒细胞的芳香化酶活性和P45 0arommRNA的水平有抑制作用。

基于人卵巢颗粒细胞KGN建立的卵泡刺激素体外生物活性效价测定法

目的:基于哺乳动物体内激素具有刺激卵巢颗粒细胞产生黄体酮(孕酮)的机理,建立尿促性素(human menopausal gonadotropin, HMG)刺激人卵巢颗粒细胞KGN分泌孕酮(progesterone, PG)法,用于评价HMG中活性成分卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)的效价。方法:用不同浓度的HMG溶液刺激KGN细胞,检测分泌上清中的PG含量,建立FSH的体外生物学活性效价测定方法;参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则9101分析方法验证和9401生物制品生物活性/效价测定方法,验证指导原则对所建立的方法进行专属性、精密度、耐用性等方法学研究;以HMG国家标准品作为基准,检测HMG国际标准品和制剂(合格和不合格)的效价。结果:不同浓度的HMG作用KGN细胞后具有时间和剂量依赖性。结论:本方法的专属性、精密度和耐用性符合《中华人民共和国药典》四部通则的要求;以HMG国家标准品为基准,能有效检测HMG国际标准品和注射用HMG的效价,与药典方法一致。

小檗碱对PCOS患者卵巢颗粒细胞雄激素分泌及糖代谢的影响

目的探讨小檗碱对多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢颗粒细胞睾酮分泌及糖代谢异常的改善作用,为小檗碱治疗PCOS的临床研究提供理论依据。方法将15例患者分为:对照组(非PCOS患者5例)、PCOS组(PCOS患者5例)、小檗碱组(PCOS患者5例),三组患者的卵巢颗粒细胞进行体外培养48h后,对小檗碱组卵巢颗粒细胞给予小檗碱干预,其他两组卵巢颗粒细胞不予干预,继续培养48 h。利用放射免疫法检测三组细胞上清液中的睾酮(T)的水平;利用葡萄糖测定试剂盒(HK法)检测三组细胞培养液中的残糖量;利用2-NBDG检测三组细胞的葡萄糖摄取情况。结果与对照组相比,PCOS组T水平增高(P <0. 05),培养液残糖量增加(P <0. 01),2-NBDG摄取量降低(P <0. 01);与PCOS组相比,小檗碱组T水平降低(P <0. 05),培养液残糖量减少(P <0. 01),2-NBDG摄取量增加(P <0. 01);小檗碱组与对照相比,T水平、培养液残糖量、2-NBDG摄取量均无显著差异(P> 0. 05)。结论 PCOS患者卵巢颗粒细胞雄激素分泌增加且存在糖代谢障碍,小檗碱能够改善其糖代谢异常并能抑制雄激素的分泌。

大气PM_(2.5)对人卵巢颗粒细胞的毒性作用及氧化损伤研究

目的研究大气PM_(2.5)对人卵巢颗粒细胞的毒性作用。方法人卵巢颗粒细胞体外培养48 h后,分别用100、200、300μg/ml PM_(2.5)溶液染毒24 h,检测细胞活力,并测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、雌二醇、孕酮、丙二醛(MDA)、caspase-3水平及超氧化物歧化酶(SOD)活力、活性氧(ROS)含量。结果随着PM_(2.5)染毒浓度的增加,人卵巢颗粒细胞活力下降,细胞培养液中雌二醇和孕酮含量下降,300μg/ml PM_(2.5)染毒组培养液中LDH含量高于对照组和100μg/ml PM_(2.5)染毒组,300μg/ml PM_(2.5)染毒组caspase-3表达高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。300μg/ml PM_(2.5)染毒组细胞MDA含量、ROS含量均高于对照组,各浓度PM_(2.5)染毒组SOD活力均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 PM_(2.5)对人卵巢颗粒细胞的毒性作用随染毒浓度的升高而增加,同时可诱导细胞氧化损伤。