人工蛋白XXA促进人源肿瘤抑素Tumstatin可溶性表达

为实现人源肿瘤抑素Tumstatin在大肠杆菌中的可溶性表达,构建了5种不同促溶性融合标签与tumstatin基因融合表达的重组大肠杆菌BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组菌进行摇瓶发酵,利用SDS-PAGE和Western-Blot分析并筛选出能可溶性表达Tumstatin蛋白的重组菌。构建的重组菌中BL21/pGEX-6p-1-Tum(含谷胱甘肽巯基转移酶标签—GST标签)、BL21/pET28a-MBP-Tum(含麦芽糖结合蛋白标签—MBP标签)、BL21/pET28a-Tum(无标签)都是以包涵体的形式表达融合蛋白Tumstatin,只有重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum(含抗冻蛋白的反向蛋白—XXA标签)能以可溶性的形式表达融合蛋白且目的蛋白占菌体总蛋白45%以上。利用亲和层析对目的蛋白进行纯化并进行Western-Blot分析,得到分子质量为50.9 kDa的目的条带,与理论分子质量一致。进一步对重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum的诱导剂添加浓度、诱导剂添加时间、诱导温度、诱导时间诱导条件进行优化。最终选择Tumstatin融合蛋白诱导条件为:诱导剂浓度0.1 mmol/L、2 h添加诱导剂、诱导温度16℃、诱导时间36 h。人源肿瘤抑素在大肠杆菌中可溶性表达为大量制备可溶性人源肿瘤抑素奠定了基础,可为功能性多肽在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。

人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素 (hPTH)全长基因 ,克隆到大肠杆菌表达载体pBV2 2 0和pET2 2b中 ,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于 95 %的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH结果完整 ,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。

重组人甲状旁腺激素肽(1-34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

人工合成人甲状旁腺激素1～34肽段(PTH134)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株。经发酵、破菌、金属螯合层析、反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH134,hPTH134肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH134一致。生物学活性研究表明,hPTH134在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

人甲状旁腺素N端34肽基因的合成、克隆及融合表达

选用大肠杆菌偏爱的密码子,用计算机辅助设计、合成长度分别为59 、59 及60 碱基的三段寡核苷酸。以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR 合成完整的hPTH(134) 基因,并克隆到pUC18 载体中。对克隆基因进行序列分析,结果与设计的完全一致。将该基因与表达载体pKA 连接构建表达质粒pKAT,转化大肠杆菌JM105 细胞,SDSPAGE 表明hPTH(134) 融合蛋白获得了表达,并且酸水解后融合蛋白被裂解为大小两个片段。

rhGH在大肠杆菌周质中的分泌表达

在大肠杆菌周质中分泌表达rhGH既有利于消除其在临床应用上的抗原性又有利于提取纯化,在rhGH的发酵生产中越来越受到青睐。就rhGH在大肠杆菌中的分泌表达机制以及启动子、引导序列、宿主菌、培养基和培养条件对分泌表达效率的影响等方面进行了综述。

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD 2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法:PCR扩增不含前导序列的HBD 2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD 2-cDNA),利用B g lⅡ和B amHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD 2-cDNA的克隆载体,利用N colⅠ和H indⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET 32-nsmHBD 2-cDNA,在大肠杆菌中BL 21(DE 3)中诱导表达含HBD 2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD 2多肽。采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD 2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD 2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD 2-cDNA几乎不含可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分。重组HBD 2对E.coli K 12 D 31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/m l时,90%细胞的生长被抑制。结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD 2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD 2多肽的原核高效表达。

重组大肠杆菌Trx-hPTH蛋白在双水相体系内的初步纯化

用双水相体系萃取技术对重组大肠杆菌表达的人甲状旁腺激素融合蛋白Trx-hPTH进行了初步纯化,考察了盐的种类、PEG的平均分子量及浓度、MgSO4浓度、pH等因素对Trx-hPTH蛋白在PEG-MgSO4体系内分配行为的影响。结果表明:当双水相体系中w(MgSO4)=0.16,w(PEG 1000)=0.20,pH为8.0时,一步萃取后目标蛋白的分配系数为3.4,回收率为88.6%。

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白。通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用SalI线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达。测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L。

重组人甲状旁腺素(rhPTH(1-84))的原核表达及发酵条件初步优化

甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)是治疗骨质疏松症的药物之一.将人工合成全长人PTH(hPTH(1-84))的核苷酸序列插入pThioHis A载体中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli.),在IPTG的诱导下,成功实现了rhPTH(1-84)的原核表达.通过发酵条件的优化,初步确定1∶40接种LB+30%M9盐溶液的发酵培养基,37℃培养至OD600 nm=0.8时,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,诱导8 h的较优发酵程序.

白蛋白修饰的人甲状旁腺激素的表达、纯化及活性鉴定

采用构建的含人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白(PTH-HSA)的酵母工程菌Pichiapastoris进行表达条件研究,发酵上清中PTH-HSA表达量为171mg/L。发酵液经超滤浓缩。