采用Gateway^(TM)系统构建人Rb94基因重组腺病毒载体

目的采用GatewayTM技术构建人Rb94基因重组腺病毒载体(Ad-hRb94)。方法从人类胚胎中提取总RNA,经反转录得到目的 cDNA,PCR扩增Rb94目的基因片段。设计含有attB侧翼序列的引物,用于重组片段的PCR扩增,在BP重组酶的作用下,将含attB位点的PCR产物与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆。在LR重组酶作用下,将入门克隆与带attR1、at-tR2位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST体外重组形成表达克隆Ad-hRb94。经PCR和测序鉴定,将Ad-hRb94线性化后转入293A细胞进行病毒的包装、扩增及病毒滴度测定。结果经PCR和测序证实目的基因Rb94片段按正确方向重组入目的载体中,带Rb94基因的目的载体在293A细胞中包装成功,获得高滴度的病毒颗粒,滴度为9.41×1010pfu/ml。结论本实验利用GatewayTM技术成功构建了Ad-hRb94,为进一步进行肿瘤基因治疗研究奠定了实验基础。