兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定

目的 :以原核表达的人硒蛋白P片段 (HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法 :在E .coli中诱导表达HSelP片段 ,经DEAEfastflow和Ni NTA Agarose柱层析纯化后 ,以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体 ,并以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果 :成功地表达并纯化了HSelP ,制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP。结论 :以原核表达并纯化的HSelP为免疫原 ,成功地制备了兔抗该蛋白的抗体 ,Westernblot鉴定特异性良好。为进一步研究硒蛋白P的功能。

人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达

目的 :探讨SeP基因与肝脏疾病特别是肝癌发生发展的关系 .方法 :采用美国Georgia大学惠赠的质粒PBluescript HumanSelenoproteinP,用PCR法制备人SePcDNA探针 ,检测了 13例正常肝脏、2 0例肝硬化、30例肝癌组织中SePmR NA的表达水平 .结果 :PCR产物经电泳鉴定与预期相符 .3种肝脏组织的组织间质均有SePmRNA表达 ,主要位于脉管区的血管内皮 ;正常肝细胞、肝硬化肝细胞及肝癌细胞中SePmRNA阳性率分别为 84 .6 % ,5 0 .0 % ,2 0 .0 % .肝癌细胞阳性表达率明显低于其他两组 (χ2 =15 .84 ,P <0 .0 0 5 ;χ2 =4 .96 ,P <0 .0 5 ) .正常肝细胞和肝硬化肝细胞的胞质及胞核内均出现蓝色的阳性颗粒 ,在胞核主要分布在核仁与核周 ;正常肝细胞的核阳性强于肝硬化肝细胞 .HCC细胞阳性表达颗粒位于胞质 ,胞核几无表达 .结论 :人SePcDNA探针制备成功 ,可用于人体组织SePmRNA的原位检测 .肝癌细胞中存在SePmRNA的表达缺失 。

亲和色谱-氢化物发生原子荧光分光光度法纯化检测人血浆中的硒蛋白-P

开发了两步亲和色谱法:肝素-琼脂糖凝胶、Ni-琼脂糖凝胶色谱纯化人血浆中硒蛋白-P的方法,并采用氢化物发生-原子荧光分光光度法(HG-AFS)检测,成功搭建了硒蛋白-P的纯化检测平台。确定了亲和色谱纯化的最佳梯度洗脱条件,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)定性检测,得到了一定纯度的硒蛋白-P,其回收率达43.2%。HG-AFS方法的线性相关系数为0.999 1,检出限为0.09μg/L,日内精密度(RSD)为0.12%,日间精密度(RSD)为0.27%,加标回收率为95%～104%。该亲和色谱纯化方法简单易控、回收率高,HG-AFS检测灵敏度高,结果准确可靠。

小同功型人硒蛋白P的诱导凋亡活性

目的 研究小同功型人硒蛋白P(HSelP)的作用。方法 克隆HSelP小同功型基因 ,将位于N端 4 0位的硒半胱氨酸 (SeCys)突变为半胱氨酸 ,测序确定后 ,在感受态大肠杆菌BL2 1中大量表达 ,表达产物HSelP2 80m用阴离子交换层析纯化 ,Westernblot方法鉴定。提取小鼠肝细胞线粒体 ,通过荧光光谱仪检测线粒体悬液 90°光散射强度和罗丹明 12 3荧光光度变化 ,确定不同浓度HSelP2 80m引起的线粒体膜透过性转运孔 (PTP)开放程度和线粒体跨膜电位的变化。结果 成功地将HSelP小同功型中SeCys点突变为半胱氨酸 ,在原核表达系统中获得大量表达。表达产物纯化后纯度达 90 %以上。HSelP2 80m可促进线粒体PTP开放 ,跨膜电位下降 ,且有剂量依赖关系 ,可被PTP的特异抑制剂所抑制。此作用在去除N端 4 0个氨基酸后丧失。结论 HSelP2 80m有促进线粒体PTP开放的作用 ,为进一步研究HSelP的结构和功能提供了线索。