黄芪多糖对过氧化氢诱导的MRC-5细胞氧化损伤的保护作用

目的研究黄芪多糖(APS)在过氧化氢(H2O2)诱导的MRC-5人胚肺成纤维细胞氧化损伤细胞模型中,对无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1(APE/Ref-1)和硫氧还蛋白(TRX)水平的影响,分析APS在氧化损伤过程中对MRC-5细胞的保护机制。方法将培养的MRC-5细胞随机分组:空白对照组、不同浓度H2O2组、(200、400、800)mg/L APS处理组。通过H2O2作用于MRC-5细胞建立细胞氧化损伤模型,使用MTT法检测H2O2对MRC-5细胞的增殖抑制率,待H2O2作用的MRC-5细胞氧化损伤模型建立后,用最佳H2O2浓度与不同浓度的APS共同作用于MRC-5细胞,确定APS对氧化损伤MRC-5细胞的最佳作用浓度;采用免疫荧光检测8-羟脱氧鸟苷(8-OHd G)含量反映MRC-5细胞DNA氧化损伤情况;应用流式细胞术检测MRC-5细胞的凋亡;采用反转录PCR分析TRX和APE/Ref-1 mRNA的水平;Western blot法检测TRX和APE/Ref-1蛋白水平的变化。结果实验表明,H2O2孵育MRC-5细胞24 h,可诱导细胞损伤,使细胞存活力下降,且具有浓度依赖性。800μmol/L H2O2浓度时建立细胞氧化损伤模型。与H2O2引起氧化损伤的模型组相比,200 mg/L的APS明显抑制H2O2引起的APE/Ref-1、TRX蛋白表达下调,降低8-OHd G含量,抑制MRC-5细胞凋亡,细胞存活率明显升高。结论 H2O2引起MRC-5细胞氧化损伤,APS促进氧化损伤的MRC-5细胞APE/Ref-1和TRX的表达,APS减轻MRC-5细胞的氧化损伤并抑制其凋亡。

重组人硫氧还蛋白对大鼠内毒素肺损伤保护作用

目的:探讨重组人硫氧还蛋白1(rh Trx-1)对新生SD大鼠急性内毒素肺损伤的保护作用.方法:制备、鉴定rh Trx-1;将新生SD大鼠分为对照组、脂多糖(LPS)实验组和LPS+rh Trx-1干预组.腹腔注射LPS(质量分数为5 mg/kg),制备急性内毒素肺损伤模型,干预组于LPS注射前30 min腹腔注射rh Trx-1(质量分数为10 mg/kg),观察注射后24 h各组新生SD大鼠的一般情况以及死亡率;重复实验,每组分别于实验后的2、8 h随机处死大鼠,提取肺组织用于病理切片观察.结果:(1)成功制备rh Trx-1;(2)LPS组大鼠表现出活动少,反应差,精神萎靡,毛发无光泽,口周发绀等全身炎症反应症状,濒死状态时表现为毛色青灰,呼吸浅表;LPS+h Trx-1干预组动物症状明显减轻;阴性对照组、LPS实验组和LPS+rh Trx-1干预组大鼠24 h死亡率分别为0%,67%、17%(2=14.400,P=0.001);(3)LPS组肺组织损伤严重,可见肺组织结构不完整,肺泡间隔明显增宽,肺泡腔内有红细胞、炎症细胞及浆液渗出,血管周围组织可见白细胞浸润,毛细血管有明显充血及扩张表现,随时间延长有加重趋势,LPS+rh Trx-1干预组病理改变较内毒素组明显减轻,肺泡结构尚正常,轻度肺水肿,肺泡间隔稍增宽,红细胞渗出明显减少,肺泡及肺间质中白细胞浸润减少.结论:重组人硫氧还蛋白1对急性内毒素肺损伤的新生大鼠具有保护作用.

人硫氧还蛋白-1基因克隆及其重组载体的构建与鉴定

目的克隆人硫氧还蛋白-1(human thioredoxin-1,hTrx1)基因,并构建含有该目的基因的重组载体。方法以人胃癌细胞系BCG823、MNK45的总RNA为模板,设计含有酶切位点的特异性引物,用逆转录PCR的方法,扩增hTrx1编码蛋白的cDNA片段,连接至EZ-T载体,形成EZ-T-hTrx1。对EZ-T-hTrx1进行双酶切后将目的片段连接至pcDNA3.1myc-His,形成pcDNA3.1myc-His-hTrx1,并进行双酶切、测序鉴定。结果双酶切鉴定显示hTrx1cDNA成功连入pcDNA3.1myc-His质粒;测序结果显示目的片段连入质粒,且与GenBank(NM003329)完全一致。该实验成功构建出含hTrx1的重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1。结论 hTrx1基因的克隆以及重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1的成功构建,为进一步探讨hTrx1的生物学活性及其对肿瘤发生的作用机制奠定了基础。

人硫氧还蛋白1多克隆抗体制备及对内毒素血症新生大鼠的保护作用

目的克隆人硫氧还蛋白1(hTrx-1)基因并在大肠杆菌表达体系中进行有效表达,制备其多克隆抗体。初步探讨hTrx-1对内毒素血症新生Sprague-Dawley(SD)大鼠的保护作用。方法从人胎肝细胞中用RT-PCR的方法得到了hTrx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌诱导表达并纯化,纯化的蛋白免疫SD大鼠,制备多克隆抗体。将新生SD大鼠分为正常组、脂多糖(LPS)组和hTrx-1组(n=12)。正常组、LPS组分别予以腹腔注射生理盐水、LPS(5 mg/kg);hTrx-1组于LPS注射前30 min腹腔注射hTrx-1(10 mg/kg)。观察正常组、LPS组与hTrx-1组新生大鼠24 h死亡率。结果成功构建PET-28a-hTrx-1原核表达载体,表达纯化了hTrx-1,获得高效价多克隆抗体。正常组、LPS组与hTrx-1组大鼠24 h的死亡率分别是0、67%、17%(χ2=14.400,P<0.01)。结论成功制备了hTrx-1多克隆抗体;初步证明了该蛋白对内毒素血症新生SD大鼠具有保护作用。