人酪氨酸羟化酶基因在猴骨骼肌直接注射后的表达

为了对多途径治疗帕金森病（ＰＤ）提供研究依据，将带人酪氨酸羟化酶基因的质粒ｐＲｃＴＨ与脂质体混合后直接注射至猴骨骼肌内，１００ｄ后取注射部位肌肉组织，以地高辛标记的ｈＴＨＲＮＡ探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，以检测该质粒在非人灵长类活体骨骼肌组织中表达的目的基因的ｍＲＮＡ水平。本研究结果表明，人酪氨酸羟化酶基因在猴体内有较高效率的表达。本研究提示，质粒可作为基因治疗的较理想的表达载体。

微囊化转TH基因人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型的研究

目的 探讨微囊化转酪氨酸羟化酶 (TH)基因的细胞在帕金森病 (PD)大鼠模型脑内存活、组织反应及对异常行为的治疗效果。 方法 以人 TH基因作为目的基因 ,重组到逆转录病毒载体感染人成纤维细胞 ,将细胞包裹在 APA半透膜中进行微囊化后 ,植入 6 -羟多巴胺单侧损毁的 PD大鼠模型纹状体内 ,观察移植物的存活状况和功能作用 16周。 结果 体外和植入体内的微囊化转基因细胞具有良好的存活能力。移植微囊化细胞可以使大鼠异常运动明显改善 ,移植位点周围的免疫反应较小。

重组质粒pcDNA3.1his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

目的 构建携带人酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase, TH)目的基因片段的真核表达重组质粒—pcDNA3. 1his hTH,与pEGFP- C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法 应用基因重组技术,将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3 .1his真核表达载体,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3 .1his- hTH的正确性;将pcDNA3. 1his hTH和pEGFP- C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞, 24h后观察EGFP瞬时表达情况, 10d后进行hTH基因RT PCR,以及hTH和 6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果⑴酶切和测序结果均证实pcDNA3 .1his hTH的正确性;⑵细胞转染 24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达, 80%以上细胞发出绿色荧光; 10d后RT PCR检测到细胞内有hTH基因的表达,免疫组化结果显示细胞有hTH和 6His抗原表达。结论 成功构建的pcDNA3 .1his -hTH和pEGFP- C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,hTH、EGFP和 6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。

CT引导脑内植入携带人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体治疗实验性帕金森病猴

目的 观察CT引导脑内注射人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体 (AAV hTH)对神经细胞的转染能力 ,以及对帕金森病 (PD)猴的治疗效应。方法 经右侧颈内动脉注射 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3,6 四氢吡啶 (MPTP)制作 6只偏侧帕金森病恒河猴模型 ,经CT引导将AAV hTH注入 5只帕金森病猴右侧尾状核内 ,观测猴模型的行为学改变 6个月以上 ,以高效液相色谱法 (HLPC)测定转染后尾状核内多巴胺 (DA)及其代谢产物含量 ,并以免疫组化检测法及逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法检测酪氨酸羟化酶 (TH)基因的表达情况。结果 CT引导定位穿刺有实时操作、定位精确、微创的优点。所有注射AAV hTH的偏侧PD猴模型术后 2周即有帕金森病症状改善 ,持续 6个月以上 ,其中 1只动物阿朴吗啡旋转实验示完全停止了帕金森病旋转现象 ,其余动物旋转次数较术前减少约4 2 %～ 70 %。实验侧与健侧尾状核区多巴胺及其代谢产物含量比值较未治疗模型增高。免疫组化染色见穿刺针道部位有大量TH阳性细胞 ;RT PCR检测到实验侧尾状核区有TH mRNA存在 ;而对照侧尾状核区、其他部位脑组织与心、肝、肾组织及未注射模型实验侧尾状核区均未见阳性发现。结论 CT引导立体定向穿刺PD猴尾状核注入AAV hTH能使TH基因精确地在特定部位有效表达 。