小反刍兽疫LAMP反应结果可视化检测方法比较研究

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种可应用于各种病原体检测、基因分型等领域的等温扩增技术。该技术所需设备简单且易于操作,因此具有较大的发展潜力。根据目前已经存在的判定LAMP结果的可视化方法,以可能对野生小反刍动物造成威胁的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)cDNA为检测对象,选择合适的引物组,比较评估均可在日光或紫外光下区分阴阳性结果的SYBR Green I、SYBR Safe Stain和羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)3种指示剂方法的适用性与灵敏度。结果表明:3种方法的灵敏度都很高,均与琼脂糖凝胶电泳相当。其中,SYBR Green I结果区分度高、不受体系成分影响且无须额外设备,但成本较高;SYBR Safe Stain具有良好的结果区分度,成本相对较低,但需要额外的紫外照射设备;HNB成本最低,但颜色区分度较低,且易受多种因素影响。建议在选择LAMP指示剂时,综合考虑成本、使用便利性、结果准确性及实验条件,通过充分的体系优化和验证,确保LAMP检测的准确性和可靠性。研究结果突显了不同方法的特征和适用场景,为研究人员根据不同场所与条件选择高效、便捷的LAMP反应结果可视化方法提供参考。

一种测定微量铝的新荧光光度法

本文提出了一种测定微量铝的新的荧光光度法。Al^(3+)与羟基萘酚兰(HNB)形成配合物的荧光强度与铝的含量在1×10^(-5)～1×10^(-8)mol/L范围内呈现良好的线性关系,检测限为3.5×10^(-9)mol/L,对4×10^(-8)mol/L铝的11次检测,其相对标准偏差为2.9％。考察了二十多种离子的干扰情况,并成功地应用于粮食及人发中铝含量的测定。

PMA-LAMP法可视化检测乳中沙门氏菌

建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。

阳离子翠蓝GB分光光度法测定色酚中2-羟基-3-萘甲酸

硝基苯作溶剂 ,用 0 .0 5 %碳酸钠水溶液萃取工业品色酚中 2 -羟基 - 3-萘甲酸 (即 2 ,3-酸 ) ,在 Na H2 PO4水溶液中 2 ,3-酸与阳离子翠蓝 GB缔合形成蓝色缔合物 ,再用氯仿将缔合物反萃取至有机相 ,分光光度法测定色酚中 2 -羟基 - 3-萘甲酸。工作曲线线性范围 0 .0～ 2 .0 mg/L( r=0 .9986) ,表观摩尔吸光系数ε=8.0 2× 1 0 4L/( mol· cm)。回收率 98.3%～ 1 0 2 .7%。运用本方法对六种工业样品进行了测定。

寨卡病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选最佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性。建立的可视化RT-LAMP方法可检测的最低浓度为101copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1~2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应。该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据。

利用环介导等温扩增技术快速可视化检测肉褐鳞环柄菇

为了实现对肉褐鳞环柄菇科学、快速的物种鉴定,利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速检测肉褐鳞环柄菇的方法,即基于肉褐鳞环柄菇ITS序列设计并验证了一套特异性引物,为进一步缩短反应时间,并增强颜色差异优化了反应体系(Bst DNA聚合酶加入量0.5μL,Mg^(2+)浓度3 mmol/L,HNB浓度180μmol/L,时间45 min,温度65℃)。结果表明:设计的引物特异性强,检测限低(7.56 pg/μL),可在60 min内通过肉眼观察羟基萘酚蓝的颜色变化判定检测结果。说明利用低成本的LAMP技术能够简单快速、灵敏准确地检测出肉褐鳞环柄菇。

对羟基萘酚兰二钠盐敏化共振光散射法测定DNA的研究

在pH10.23的Tris-HCl缓冲溶液中,阴离子主体小分子对羟基萘酚兰二钠盐(HNB)对阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)与脱氧核糖核酸(DNA:fsDNA、ctDNA)的共振光散射光谱有协同增强作用.考察了共振光散射(RLS)光谱的影响因素,在优化条件下共振光散射强度增加值(ΔI)与DNA浓度之间呈良好的关系,据此建立了一种测定DNA的新方法,该方法具有反应速度快(只须1min)、稳定性好、灵敏度高等特点.对于fsDNA、ctDNA的线性范围分别为0.05～2.5 mg/L,0.04～2.0 mg/L,检出限分别为25.9 ng/mL,24.9 ng/mL.用于fsDNA合成样测定效果较好.

猪传染性胃肠炎病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

通过对比猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)主要流行毒株的M基因序列,选择其高度保守的区域设计LAMP引物,以羟基萘酚蓝(HNB)为指示剂,建立了1种快速检测TGEV的可视化环介导等温扩增方法。结果显示,采用建立的方法在恒温水浴锅中约1 h即可完成检测;用该方法检测猪流行性腹泻病毒,猪轮状病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪细小病毒,猪圆环病毒,均不发生交叉反应;以pET-21b-M质粒为模板评价所建立方法的敏感性,最低检测限为3.7×10^3个拷贝,比普通PCR方法高2个数量级;在反应前向反应体系中加入HNB,反应结束后阳性反应管颜色从紫罗兰色变为天蓝色,阴性反应管颜色无变化,且阴阳性管颜色差异明显。用建立的方法对收集的42份临床腹泻样品进行检测,共检测到21份样品阳性。为快速检测TGEV提供方法。