荧光增白剂与增效蛋白对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)的增效作用

围食膜是昆虫中肠细胞与肠腔之间的一种防御性屏障,破坏围食膜即能促进病原微生物对昆虫的侵染。分别研究了荧光增白剂FB28和棉铃虫Helicoverpa armigera颗粒体病毒增效蛋白(En-Ha)对美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HcNPV)的增效作用,分析了活体条件下FB28与En-Ha对美国白蛾幼虫围食膜的破坏作用,解释了其增效作用机理。生物测定结果表明,FB28和En-Ha均能够影响围食膜蛋白的表达谱,提高HcNPV的感染率,使其毒力显著提高:单独饲喂HcNPV时的LC50值为1.11×105PIBs/mL,添加FB28和En-Ha后,其LC50值分别降低为1.91×103和7.70×103PIBs/mL,增效比值(SR)分别为58.12和14.42。SDS-PAGE电泳结果发现:用FB28饲喂处理幼虫后,分子质量为60 ku的蛋白条带消失,37 ku的新蛋白条带逐渐出现;幼虫摄取含有En-Ha的饲料后,分子质量为75 ku的蛋白条带消失,44.3 ku的新蛋白条带逐渐出现。经过10～24 h后,FB28和En-Ha处理的幼虫围食膜都能够恢复正常,表明其破坏作用是短暂的。

美国白蛾核型多角体病毒传播途径及对寄主的持续作用

用不同浓度的美国白蛾核型多角体病毒亚致死剂量感染美国白蛾4龄和5龄幼虫,并分别收集不同处理的残余带毒试虫进行室内传代饲养。结果表明:病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用,而且对蛹重和雌虫产卵量均有明显影响,尤其是对亲代、子一代和子二代寄主昆虫。对病毒传播途径的研究证实HcNPV可通过多种途径传播到寄主种群中。

美国白蛾核型多角体病毒p35基因的克隆及序列分析

对美国白蛾核型多角体病毒 (HycuNPV ,Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)p35基因的序列分析表明 :HycuNPVp35编码序列 90 0bp ,编码 2 99氨基酸。同源性分析表明 :HycuNPVp35与BomoNPVT3、AucaNPV、SpliNPV、LeseNPV、HearNPV在核苷酸水平上为 99 9%、 95 7%、 93 6 %、 80 2 %和 87 2 % ,在氨基酸水平上为 99 7%、 90 3%、 77%、 6 4 9%和 73 2 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BomoNPVT3中位的H1 2 2 ,在HycuNPV中被R取代。推测HycuNPVp35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BomoNPVT3p35蛋白的相似。

重大外来入侵害虫——美国白蛾生物防治技术研究

美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)是重大外来入侵害虫,对我国林业和园林绿化造成重大危害,尤其是近年来美国白蛾传入北京,严重威胁着我国“绿色奥运”的顺利举办和首都园林绿化及生态环境安全。根据美国白蛾多发生在居民区、乡镇和城市的特点,作者开展对环境安全的生物防治技术研究。汲取前苏联等国家从美国白蛾的原产地引进天敌进行生物防治没有成功的经验和教训,立足调查和寻找我国本土天敌。经过21年的努力,发现和筛选出白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea Yang(新属新种)这种寄生美国白蛾的特优天敌;研究这种小蜂的行为学、生态学、生物学、解剖学及人工大量繁殖、放蜂防治技术;筛选出人工大量繁殖小蜂的替代寄主,解决小蜂的大量繁殖的瓶颈问题;通过放蜂防治试验,取得良好的防治效果。同时,筛选出防治美国白蛾的高毒力HcNPV病毒毒株,研制出美国白蛾人工饲料,利用人工饲料大量饲养美国白蛾幼虫,然后接种扩增病毒,成功解决HcNPV病毒大量扩增生产和常年生产的技术难题,做到病毒的规模化生产和常年生产,保证大面积生产防治的需要和病毒质量。研究出利用天敌昆虫和病原微生物综合应用的防治模式:在美国白蛾幼虫期喷洒HcNPV病毒,蛹期释放白蛾周氏啮小蜂,达到既控制当代美国白蛾的危害,又有效抑制其下代的种群数量,取得长期的持续控制美国白蛾的防治效果。上海市、大连市、烟台市和青岛市利用该项技术已经完全控制美国白蛾,特别是上海市利用本项生物防治技术防治后,已经连续6年没有再发现美国白蛾。由于该项生物防治技术利用的是自然界原有的控制害虫的生态因子,因而对环境安全,做到既消灭害虫,又保证生态环境和人畜的安全,也保护生物多样性。该项研究成果也为北京采用“绿色”防治技术有效控制美国白蛾提供重要的科技支撑和技术保障。

美国白蛾核型多角体病毒室内大量增殖的研究

研究了饲毒时美国白蛾幼虫虫龄和饲毒剂量对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)青岛分离株产量的影响,从而探寻HcNPV室内大量增殖的最佳条件。结果表明,虫龄、剂量以及虫龄和剂量的组合对单头幼虫的HcNPV产量、幼虫死亡率以及病毒总产量均具有极显著的影响,在室内大量增殖HcNPV时,以1.48×106 OBs/头的饲毒剂量饲喂5龄和6龄幼虫均可以获得最高的病毒产量,百头幼虫的病毒总产量分别达到1.55×1011 OBs和1.50×1011 OBs。

美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立对昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus)进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品DNA进行检测,构建出美国白蛾核型多角体病毒SYBR GreenⅠ荧光定量标准曲线。统计学分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R=0.998)。该方法的检测灵敏度为101～102拷贝/μL,线性范围达5个数量级,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间的变异系数均小于3%。根据已建立的方法对不同感染时间段的感病幼虫进行检测,每毫克幼虫样本内病毒polyhedrin基因拷贝数增殖倍数对数值与感染时间(d)呈正相关(R=0.987)。这些结果表明,建立的美国白蛾核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法是可靠的,具有灵敏度高、重复性好等特点,可为昆虫核型多角体病毒体内增殖动态研究及昆虫病毒的标准化生产提供参考。

入侵害虫美国白蛾综合防治研究概述

美国白蛾(Hyphantria cunea)是一种重要的入侵害虫,近年来在我国多个地区爆发,对农林业造成巨大的经济损失。该文对美国白蛾的种群特点和分布、基因组学、性信息素研究以及生物防治等方面的研究现状作了简要综述,以期为其防治研究提供参考。

美国白蛾核型多角体病毒防治美国白蛾林间药效试验

应用不同浓度的美国白蛾核型多角体病毒感染美国白蛾3~4龄幼虫,试验结果表明:施药后3 d试虫开始死亡,10 d死亡率达到50%,13~14 d后,试虫死亡率达到高峰期,15 d后,除3×106 PIB·mL^-1处理浓度外,其他各处理试虫校正死亡率均高于90.28%,防治效果显著。综合防效和成本,生产中建议使用核型多角体病毒防治美国白蛾时选择5×106 PIB·mL^-1及以上浓度。

基于PCR方法的美国白蛾核型多角体病毒早期检测

根据美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HcNPV)pe38基因设计两对引物,利用PCR法检测HcNPV基因组DNA,分别扩增出长为994和614bp的片段,经测序确定为HcNPV pe38基因片段。应用两对引物分别检测了美国白蛾病虫的总DNA和获得的病毒多角体,其检测最低量分别为1fg病虫总DNA和3～4OBs/mL。用不同浓度的病毒感染试虫后,不同时间取其血淋巴用PCR方法检测。结果表明,接毒量为3.53×109OBs/mL时,24h后可检出病毒DNA;接毒量为3～4OBs/mL时,120h后可检出。病毒可检出时间随接毒浓度的递减而延后。

美国白蛾核型多角体病毒林间药效试验

美国白蛾核型多角体病毒Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus(简称HcNPV)对2～3龄美国白蛾幼虫的药效试验结果表明,药后14 d,青岛农业大学生防所提供的HcNPV 1 000,750,500倍液校正防效分别为73.29%,87.67%,90.41%;北京蓝狐天敌技术有限公司提供的HcNPV 1 000,750,500倍液校正防效分别为78.77%,88.36%,89.04%。

3-溴丙酮酸对美国白蛾核型多角体病毒的增效作用

[目的]利用3-溴丙酮酸(3-BrPA)作为美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)的生物增效剂,探讨3-BrPA对HycuNPV的毒力和对美国白蛾生长发育的影响,为进一步推进HycuNPV杀虫剂的应用提供新的增效剂。[方法]通过室内在HycuNPV中添加不同剂量3-BrPA,分析其对HycuNPV的增效作用以及对美国白蛾生长发育的影响。[结果]室内生物活性结果表明,3-BrPA对HycuNPV具有增效作用,不仅可以提高HycuNPV的感染能力,还能提高杀虫速度。当3-BrPA的添加剂量为5.0、10.0和15.0 mg·g^(−1)时,HycuNPV作用于美国白蛾3龄幼虫的LC_(50)都有不同程度地降低;并且对HycuNPV的增效倍数(S_(R))分别为825.14、164.72和0.47,共毒系数(CTC)分别为82613.63、16579.25和147.27。不同浓度的HycuNPV在不同剂量的3-BrPA作用下,其杀虫效果各不相同。添加不同剂量的3-BrPA,LT_(50)缩短了3.280~9.724 d。根据SR、CTC、LT_(50)及ST等指标评判,在浓度为9.0×10^(5)OBs·mL^(−1)的HycuNPV中添加5.0 mg·g^(−1)的3-BrPA时,增效作用最优。此外,3-BrPA和HycuNPV联合作用还显著抑制了幼虫的生长发育,且存活幼虫的化蛹率和羽化率均低于单独使用病毒杀虫剂。[结论]3-BrPA对HycuNPV具有增效作用,有望作为理想的病毒杀虫剂的增效剂。

病毒和细菌类生物制剂防治美国白蛾试验

采用美国白蛾核型多角体病毒和苏云金杆菌对美国白蛾幼虫进行了防治试验,效果均在74%以上。生物防治能有效地保护人居环境不受污染,保护自然界天敌,形成自控的生态系统,降低美国白蛾的危害。

基于RNAi技术解析美国白蛾HcAnk1和HcAnk2基因功能及对HcNPV的敏感性(英文)

【目的】锚定蛋白是连接细胞骨架与质膜的衔接蛋白家族。但昆虫中关于锚定蛋白基因功能研究甚少。笔者克隆美国白蛾(Hyphantria cunea)锚定蛋白基因,阐明该基因在其各发育期和组织中的表达特征及对美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrosisvirus,HcNPV)的敏感性,为进一步开发HcNPV增效剂提供理论依据。【方法】通过转录组文库筛选出Ankyrin1(HcAnk1)和Ankyrin2(HcAnk2)基因,利用生物信息学分析基因特性,采用qRT-PCR检测不同发育阶段、不同组织以及不同HcNPV浓度胁迫下HcAnks的表达量,通过RNAi技术研究HcAnks基因沉默后美国白蛾对HcNPV的敏感性。【结果】HcAnk1和HcAnk2基因开放阅读框依次为1392和1866 bp,分别编码463和621个氨基酸,蛋白质分子质量分别为59.18和69.19 ku,理论等电点分别为5.74和8.66;进化树分析显示HcAnk1与粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)亲缘关系最近而聚为一类。HcAnks在各个发育阶段均有表达,卵期表达量最高,6龄表达量最低;HcAnks分别在中肠和后肠中表达量最高;在卵巢和精巢中未检测到HcAnk1,而HcAnk2主要在中肠和精巢中表达。在不同浓度HcNPV胁迫下,HcAnks转录水平表现为低浓度诱导,高浓度抑制。沉默HcAnks美国白蛾4龄幼虫的相对生长率(RGR)和食物转化效率(ECD)显著降低。此外,沉默HcAnks的美国白蛾4龄幼虫对HcNPV敏感性显著增加。【结论】HcAnks在抵抗HcNPV侵染过程中发挥重要作用,HcAnks可作为HcNPV增效剂,用于美国白蛾无公害防治。

利用核型多角体病毒防治美国白蛾的试验

美国白蛾核型多角体病毒对2~4龄美国白蛾幼虫的野外防治试验结果表明:药后4 d大量幼虫开始死亡,14 d后达到高峰,病毒防治率达到90.6%以上。幼虫对病毒的敏感性随着虫龄的增大而减弱,并且对其子代也有很好的防治效果。

美国白蛾核型多角体病毒与四种常用化学杀虫剂的复配增效作用研究

【目的】比较甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(简称:甲维盐)、高效氯氰菊酯、灭幼脲和苦参碱4种常用杀虫剂对美国白蛾Hyphantriacunea幼虫的杀虫活性,筛选出和美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HycuNPV)混配后具有显著增效作用的杀虫剂,明确其最佳混配比例,从而为今后美国白蛾的高效防治提供依据和参考。【方法】以美国白蛾3龄幼虫为试虫,采用人工饲料表面涂布法分别测定美国白蛾核型多角体病毒和4种化学杀虫剂的毒力。利用共毒因子法评价4种杀虫剂与HycuNPV混配后的杀虫效果,明确具有显著增效作用的化学杀虫剂,并研究其使用的最佳增效配比和浓度。【结果】供试的4种杀虫剂对美国白蛾3龄幼虫的毒力大小顺序为甲维盐>高效氯氰菊酯>灭幼脲>苦参碱,其致死中浓度(Medianlethal concentration,LC_(50))依次为0.021、2.149、4.522和70.255 mg·L^(﹣1)。HycuNPV与甲维盐分别以致死中浓度混配后表现出显著的增效作用,且两者体积比1︰9时增效作用最为显著,其增效比值为29.06倍,致死中时间(Median lethal time,LT_(50))与仅用HycuNPV相比缩短了2.89 d。【结论】4种杀虫剂中甲维盐对美国白蛾3龄幼虫毒力最高,且与HycuNPV复配后具有最显著的增效作用。当HycuNPV与甲维盐的浓度分别为0.021 mg·L^(﹣1)和1.18×10^(6)OBs·mL^(﹣1),且体积比为1︰9的复配比例下效果最好。

美国白蛾核型多角体病毒增殖和保存的影响因素

【目的】明确美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nudeopolyhedroviurs,HcNPV)的最佳增殖方法和最适保存条件,为HcNPV标准化生产提供理论依据和技术支撑。【方法】利用活体增殖法,探究不同饲毒虫龄-病毒浓度组合、持续饲毒时间、幼虫饲毒温度和密度对HcNPV增殖量的影响,筛选最佳的HcNPV活体增殖方法;并利用生物活性测定法,研究不同病毒保存处理方式、保存时间、保存温度和保存剂对HcNPV活性的影响,明确最佳的保存条件。采用喂食法处理美国白蛾幼虫,利用血球计数板统计HcNPV增殖数量,以半数致死时间(LT_(50))为指标评价病毒的杀虫活性。【结果】当饲毒浓度为1×10^(6)OB·mL^(﹣1)、虫龄为5龄时病毒的增殖量为1.16×10^(10)OB/头,显著高于其他供试浓度和龄期;以3龄幼虫作为供试虫龄,饲毒浓度为1×10^(6)OB·mL^(﹣1)时,研究发现最佳饲毒温度为20℃,病毒增殖量达5.06×10^(9)OB/头;随着持续饲毒时间的延长,病毒增殖量显著降低,从3.42×10^(9)OB/头降低至0.97×10^(9)OB/头;幼虫饲毒密度为100头/箱(0.05头/cm^(2))时,病毒增殖量显著高于200-500头/箱,增殖量为4.94×10^(9)OB/头。不同保存方法对HcNPV杀虫活性具有不同程度的影响。以病毒虫浆法和虫尸干燥粉碎法保存的病毒感染美国白蛾3龄幼虫的LT_(50)显著低于病毒液法和病毒干粉法;当保存时间不超过12个月时,病毒杀虫活性无显著变化;保存温度范围为﹣20-25℃时,病毒的杀虫活性未出现显著变化;筛选出最佳的保存剂为蔗糖(50%)和氯化钠(5%),LT_(50)分别为4.94 d和4.97 d。【结论】在幼虫密度为0.05头/cm^(2)的养虫箱中,使用浓度为1×10^(6)OB·mL^(﹣1)的HcNPV饲喂美国白蛾5龄幼虫一次,20℃下可获得最高产量的病毒;感病幼虫虫尸研磨成匀浆,添加蔗糖(50%)或氯化钠(5%)作为辅助剂,置于﹣20℃的冰箱内保存,可在12个月内保证HcNPV的最佳活性。