双参宁心方血清药物化学和抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验研究

目的研究双参宁心方(SSNX)主要有效成分及其对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法利用血药指纹图谱检测来源于SSNX的血中成分,并利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤实验进行验证。结果给药后血清样本中,共检测到15个来源于SSNX的原型成分,其中确定了人参皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素、脱氢紫堇碱4个化学成分。在对心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验中,人参皂苷Rg1、脱氢紫堇碱能抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤导致的乳酰脱氢酶升高(P<0.05),丹酚酸B、延胡索乙素则能显著抑制乳酸脱氢酶的升高(P<0.01),对心肌细胞具有保护作用。结论提示人参皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素、脱氢紫堇碱可能是SSNX抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的有效物质基础,可用于复方药代动力学的指标检测。

急性低氧和复氧对牛主动脉内皮细胞损伤的研究

本实验通过一个自制的用于低氧研究的装置，将细胞暴露于严重低氧条件下（ＰＯ２＝５．３ＫＰａ）观察不同时间低氧和复氧时内皮细胞超微结构和存活率的变化。研究显示随低氧时间延长细胞存活率逐步降低，急性低氧后再复氧细胞存活率进一步降低。细胞超微结构损伤也随低氧时间延长逐步加重，低氧后再复氧超结构损伤程度进一步加重。实验观察到在急性低氧和复氧条件下，培养的牛主动脉内皮细胞超微结构损伤以脂质体和空泡的增加为其最明显特点，而不是线粒体和内质网等细胞器的肿胀和破裂。用ＳＯＤ孵育（１５０μ／ｍｌ）能减少复氧引起的牛主动脉内皮细胞死亡（Ｐ＜０．０５），提示复氧时可能有超氧自由基产生，并在细胞损伤中起重要作用。

膀胱癌组织HIF-1α与Survivin、Bcl-2表达的关系和意义

目的探讨膀胱癌组织中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、生存素(Survivin)、Bcl-2的表达关系和临床意义。方法对68例膀胱移行细胞癌组织和20例正常膀胱组织石蜡标本进行免疫组化(SP)染色,检测HIF-1α与Survivin、Bcl-2的表达情况。结果膀胱癌组织中HIF-1α、Survivin、Bcl-2与正常膀胱组织相比均明显增强(P<0.05);3种蛋白质表达随病理分级、分期的升高而升高(P<0.05);复发膀胱癌组织中HIF-1α、Survivin表达较初发膀胱癌组织增强(P<0.05);相关分析显示,HIF-1α与Survivin、HIF-1α与Bcl-2表达均存在正相关关系(r=0.4486,0.3428,0.2016,P<0.05)。结论 HIF-1α在膀胱癌组织中表达增强,且随肿瘤进展表达进一步升高;其机制在于HIF-1α可能通过调节Survivin、Bcl-2表达而增强膀胱癌细胞的抗凋亡能力促进膀胱癌进展。

新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是指围产期窒息导致脑的缺氧缺血性损害,临床出现一系列中枢神经异常的表现。其诊断根据临床表现,同时具备以下4条者可确诊,第4条暂时不能确定者可作为拟诊病例:①有明确的可导致胎儿宫内窘迫的异常产科病史,以及严重的胎儿宫内窘迫表现(胎心<100次,持续5min以上;和/或羊水III度污染),或者在分娩过程中有明显窒息史;②出生时有重度窒息,指Apgar评分1min≤3分,并延续至5min时仍≤5分;或者出生时脐动脉血气pH≤7. 00;③出生后不久出现神经系统症状、并持续至24h以上;④排除电解质紊乱、颅内出血和产伤等原因引起的抽搐,以及宫内感染、遗传代谢性疾病和其他先天性疾病所引起的脑损伤。本诊断标准仅适用于足月新生儿HIE的诊断。

模拟高原间断缺氧暴露对雌性大鼠动情周期的影响

目的探讨模拟高原间断低氧暴露对雌性大鼠动情周期的影响。方法健康雌性SD大鼠适应性喂养5 d后随机分为两组,每组11只,分别为(1)正常对照组:在标准温湿度条件下饲养;(2)低氧暴露组:每天于低压舱进行8 h模拟高度为6000 m的低氧暴露。实验周期为4周,实验期间动物自由摄食饮水,每天记录摄食量,每周称量2次体质量,计算低氧暴露对雌性大鼠体质量及摄食量的影响;采取脏器质量/体质量计算低氧暴露对雌性大鼠重要脏器系数的影响;阴道脱落细胞形态变化(2次/d)观察大鼠动情周期的变化情况;放免法(radioimmunoassay,RIA)检测血清性激素水平;分别采用二硫代二硝基苯甲酸(dithiobisnitrobenzoicacid,DTNB)法、羟胺法和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法检测血清谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果与正常对照组相比,低氧暴露7 d内大鼠摄食量显著降低,低氧暴露10 d内大鼠体质量显著降低;脏器系数结果表明低氧暴露可导致雌性大鼠肾脏、肝脏、脾脏系数显著升高,但对雌性大鼠子宫、卵巢系数无显著影响;阴道脱落细胞形态分析结果显示低氧暴露显著导致雌性大鼠动情期和动情后期的延长以及动情间期的缩短;血清性激素结果显示低氧暴露导致雌性大鼠血清孕酮(progesterone,P)和促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平显著降低;血清氧化抗氧化指标结果显示,与正常对照组相比,低氧暴露组血清GSH-Px、SOD活性显著降低,MDA含量显著升高。结论低氧暴露可显著导致雌性大鼠动情周期紊乱,这可能与机体氧化和抗氧化能力失衡有关。

缺氧及沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因表达的影响

目的观察缺氧及应用小干扰RNA（siRNA）沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因对胰腺癌细胞株BxPC-3中RUNX3基因表达的影响。方法构建人RUNX3基因真核表达载体质粒pEGFP—RUNX3，CoCl2化学模拟肿瘤缺氧环境，检测缺氧以及siRNA沉默HIF-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因在mRNA和蛋白水平的影响。结果缺氧能使BxPC-3细胞中RUNX3基因的表达较常氧时显著升高[表达为（9．13±1．55），P〈0．05]，siRNA转染BxPC-3细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达（抑制率90％），并导致RUNX3基因的表达也受到明显抑制。结论缺氧促使BxPC-3细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高，缺氧时HIF-1α能上调RUNX3基因的表达水平。

低氧诱导因子-1α沉默对膀胱癌细胞血管内皮生长因子和葡萄糖转运蛋白-1表达的影响

目的采用RNA干扰技术（RNAi）技术观察低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对膀胱癌细胞株B1U-87血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）表达的影响。方法体外培养人膀胱癌BIU-87细胞，荧光定量聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测低氧（90％氮气＋5％氢气＋5％二氧化碳）和常氧下HIF-1α、VEGF、GLUT-1的表达；Western blot检测HIF-1α-siRNA的转染效果及转染前后细胞VEGF、GLUT-1的表达；采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测HIF-1α-siRNA转染后的细胞增殖。结果低氧8、24h条件下，BIU-87中HIF．1仪蛋白（0．56±0．08、1．33±0．21）、VEGFmRNA（2．12±0．29、3．27±0．46）、VEGF蛋白（0．29±0．04、0．59±0．10）、GLUT-1mRNA（1．99±0．22、3．95±0．48）、GLUT-1蛋白（0．384-0．05、0．65±0．11）表达均较正常氧条件下HIF-1α蛋白（O．33±O．05）、VEGF mRNA（0．97±0．11）、VEGF蛋白（0．98±0．16）、GLUT-1 mRNA（1．05±0．12）、GLUT-1蛋白（1．46±0．24）表达显著升高（P〈0．05），而HIF-1α mRNA在低氧8、24h（1．05±0．09、0．96±O．11）与正常氧（1．16±O．13）条件下差异无统计学意义（P〉0．05）；HIF-1α-siRNA转染能有效沉默HIF-1α,转染后BIU-87增殖水平（0．63±0．08）与转染前（1．12±0．17）比较明显降低（P〈0．05），转染后VEGFmr^NA（O．43±O．05）和蛋白（0．58±0.07）表达比转染前（1．08±0.12、1．19±0．17）降低（P〈0．05），GLUT-1mltNA和蛋白（0．56±0．06、0．51±0．07）表达比转染前（1．07±0．18、1．16±0．16）降低。结论低氧条件下，HIF-1α-siRNA能通过沉默HIF-1α，抑制BIU-87细胞VEGF、GLUT-l表达，从而抑制膀胱癌细胞增殖。

缺氧应激对HepG2细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因表达的影响

目的观察体外缺氧条件下肝癌细胞株HepG2中缺氧诱导因子-α（HIF-α）和甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）的表达，探讨HIF-α在低氧条件下对MAT2A基因表达的调控作用。方法构建人MAT2A启动子真核表达载体质粒，CoCl2化学模拟肿瘤缺氧环境，检测缺氧条件下MAT2A启动子活性，HIF-α和MAT2A在HepG细胞中的共定位、mRNA和蛋白水平的表达。以及小干扰RNA（siRNA）沉默HIF-α后对MAT2A基因表达的影响。结果缺氧24h能使HepG2细胞活性增加到高峰（41．26±2．34），同时MAT2A基因的表达也较常氧时显著升高（P〈0．01），siRNA转染HepG2细胞后能显著下调HIF-α蛋白表达（抑制率90％），并导致MAT2A基因的表达也受到明显抑制。结论缺氧促使HepG2细胞中HIF-α在蛋白水平表达升高，缺氧时HIF-α能上调MAT2A基因的表达水平。

灯盏细辛对低氧环境下肺成纤维细胞Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1表达的干预作用

目的研究灯盏细辛对低氧环境下肺成纤维细胞Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶1(MMP1)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)表达的影响。方法以人胚肺成纤维细胞系MRC-5为研究对象,Western blot法检测常氧、低氧、丝/苏氨酸激酶抑制剂星型孢菌素(straurosporine,SP)、灯盏细辛作用下MRC-5缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)、Ⅰ型胶原前α1链(pro-col1α1)、p-smad2蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1蛋白的含量。结果体外培养的MRC-5,常氧环境下细胞内表达一定的pro-col1α1、p-smad2蛋白,几乎不表达HIF-1α,细胞外基质有较低水平的Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1蛋白表达;低氧环境下细胞内pro-col1α1、p-smad2蛋白、HIF-1α和细胞外基质Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1均较常氧组表达增加(P<0.05);SP(5nmol/L)预处理细胞30min与单纯低氧组比较,其胞内的p-smad2蛋白、pro-col1α1和基质中的Ⅰ型胶原、TIMP1降低(P<0.05),而基质中的MMP1表达增加(P<0.05);灯盏细辛组(12.5μg/mL、50μg/mL)与单纯低氧组比较其胞外的Ⅰ型胶原、MMP1、TIMP1蛋白和胞内的HIF-1α、pro-col1α1和p-smad2蛋白表达均有降低(P<0.05)。结论灯盏细辛可降低低氧环境下HIF-1α蛋白的表达,并部分通过p-smad2信号通路抑制Ⅰ型胶原、TIMP1蛋白生成。

低氧诱导因子-1α沉默对膀胱癌细胞株BIU-87增殖、侵袭及转移的影响

目的采用RNA干扰技术（RNAi）技术观察低氧诱导因子-1a（HIF-1a）对人膀胱癌细胞株BIU一87增殖、侵袭及转移的影响。方法体外培养BIU-87细胞，实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCIt）和Westernblot检测低氧（90％氮气＋5％氢气＋5％二氧化碳）和常氧下及HIF—lcx—siRNA转染前后BIU-87中HIF-1a、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达；采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测HIF-a-siRNA转染后的细胞增殖水平，细胞划痕和Transwell试验检测迁移和侵袭能力。结果低氧8、24h条件下，HIF—ln蛋白（0．56±0．08、1．33±0．21）、MMP-2mRNA（1．85±0．21、2．94±0．29）、MMP-2蛋白（0．68±0．11、1．37±0．22）、MMP一9mRNA（2．08±0．32、3．49±0．44）、MMP一9蛋白（0．89±0．12、1．40±0．23）表达与正常氧条件比较HIF一1d蛋白（0．33±0．05）、MMP一2mRNA（O．95±0．13）、MMP-2蛋白（0．47±0．07）、MMP-9mRNA（1．21±0．17）、MMP一9蛋白（0．58±0．14）表达均显著升高（均P〈0．05），HIF-1a mRNA（1．05±0．09、0．96±0．11）与正常氧条件（1．16±0．13）比较无明显变化；HIF-1a-siRNA转染后与转染前比较能有效沉默HIF—1a与转染前（1．12±0．17、315．25±40．94、96．86±9．85）比较，HIF。1饯．siRNA能降低增殖、侵袭及迁移细胞数（0．63±0．08、139．62±19．67、69．17±7．39）（均P〈0．05）；BIU一87中PCNAmRNA（0．57±0．07）、PCNA蛋白（0．52±0．09）、MMP-2mRNA（0．64±0．08）、MMP-2蛋白（0．53±0．07）、MMP-9mRNA（0．49±0．06）、MMP-9蛋白（0．69±0．07）表达与转染前比较显著降低（0．99±0．14、0．80±0．13、1．06±0．13、0．87±0．12、0．99±0．12、1．12±0．14）（P〈0．05）。结论低氧下，HIF一10l—siRNA通过沉默HIF-1a，降低PCNA、MMP-2、MMP-9表达而抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭及转移。

活性氧簇在低氧诱导的肺纤维化中的作用

活性氧簇是一类氧的衍生分子,因其可引起蛋白质、DNA等大分子物质损伤、脂质过氧化,一直被认为是有害因子.近年来研究表明活性氧簇的产生是受精细调节的,并且它能作为第二信使激活细胞内MAPK（ERK1/2、p38MAPK和JNK）、Akt/PKB、JAK-STAT、核因子κB等多条信号通路,参与转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、缺氧诱导因子、结缔组织生长因子等多种致纤维化因子的信号转导,调节细胞的增殖、分化、凋亡等生理功能,并与动脉粥样硬化、肝纤维化、肺纤维化等疾病的发生有关.低氧是一个重要的病理过程,可引起细胞损伤、组织炎细胞浸润,并能促进上皮细胞向间质细胞转化、细胞外基质沉积,上调转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、缺氧诱导因子、结缔组织生长因子等多种致纤维化因子,故低氧有诱导肺纤维化形成的可能.而低氧又可引起活性氧簇产生增多.本文就活性氧簇在低氧诱导的肺纤维化中的作用作一综述.

siRNA沉默缺氧诱导因子-2α对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响和机制

目的探讨缺氧诱导因子-2仅（HIF-2a）沉默对胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响及其机制。方法常规培养SGC7901细胞，实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）和Westernblot法检测低氧组（90％氮气＋5％氢气＋5％二氧化碳）和正常氧条件下HIF-2a、B淋巴细膨白血病-2（bel-2）、bcl-2相关x蛋白（bax）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）-3的表达；合成针对HIF-2a的小干扰RNA（HIF-2a-siRNA）；Westernblot检测HIF-2a-siRNA的转染效果；细胞计数试剂盒（CCK）法检测-HIF-2a-siRNA转染后的细胞增殖，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率；FQ—PCR和Westernblot检测转染前后bcl-2、bax、Caspase-3的表达。结果低氧条件下，HIF-2a（2．94±0．31、0．61±0．08）、bcl-2（2．01±0．29、1．05±0．09）mRNA和蛋白表达与正常氧条件下HIF-2仅（1．06±0．15、0．23±0．04）、bcl-2（1．08±0．16、0．34±0．05）比较明显升高，bax（0．54±0．06、0．48±0．05）、Caspase-3（0．45±0．05、0．58±0．07）mRNA和蛋白表达与正常氧条件bax（0．97±0．13、0．74-4-0．12）、Caspase-3（0．96±0．12、0．89±0．14）比较则明显降低（P〈0．05）；HIF-2a-siRNA转染后与转染前比较能有效沉默HIF-2d；HIF-2cx—siRNA转染后[（0．47±0．05）％]与转染前[（0．89±0．12）％]比较能抑制增殖水平，与转染前[（8．15±0．97）％]比较，转染后[（20．16±3．09）％]凋亡率升高（P〈0．05）；与转染前（0．96±0．09、1．37±0．21、1．13±0．19、0．82±0．16、0．97±0．13、0．69±0．11）比较，转染后可降低bcl-2mRNA和蛋白表达（0．43±0．06、0．78±0．12），升高bax（2．91±0．28、1．51±0．28）、Caspase-3mRNA和蛋白表达（2．42±0．34、1．34±0．21）（P〈0．05）。结论低氧下，HIF-2cx—siRNA可通过降低bcl-2表达、升高bax、Caspase-3表达而诱导SGC7901细胞凋亡。