腺病毒介导IκBα基因在体外培养U_(937)细胞中的表达及效应研究

目的 通过构建IκBα基因的腺病毒表达载体 ,并用急性相反应蛋白SAA3 启动子来指导目的基因IκBα的表达 ,体外观察在炎性刺激后IκBα蛋白的诱导性表达特性及对NF κB活性的调控作用 ,对炎症介质产生的抑制效应。方法 采用DNA重组与同源重组技术 ,构建含只响应病理信号的启动子 急性相反应蛋白启动子SAA3 、目的基因IκBα的炎症诱导性复制缺陷型重组腺病毒载体 (AdIκBα)。应用AdIκBα,选择在炎症反应中具有代表意义的巨噬细胞 ,观察AdIκBα在体外培养巨噬细胞U93 7中诱导性表达IκBα(Westernblot)、对NF κB活性的调控 (EMSA)及体外效应。结果 ①成功构建炎症诱导性IκBα表达质粒 (pAdpLplSAA3 NLSIκBα) ,该表达框含SAA3 启动子 ,SV40 大T抗原核定位信号 (NLS) ,IκBαcDNA和ployA ;②pAdpLpLSAA3 NLSIκBα质粒与pJM1 7同源重组 ,脂质体 (DOTAP)介导 ,共转染入 2 93细胞。PCR法筛选阳性克隆 ,获得重组腺病毒 (AdIκBα) ;③用 2 93细胞扩增AdIκBα;采用反复冻融法纯化腺病毒 ,获得高滴度 (5× 1 0 1 0 pfu/ml)重组腺病毒 ;④体外实验 ,用 50MOIAdIκBα预感染体外培养的U93 7细胞 ,再用LPS攻击后 ,该腺病毒诱导性表达IκBα蛋白 (Westernblot) ,且表达的IκBα能抑制NF κB的活化 (EMSA)

中国人IκBα基因的克隆和序列分析

目的克隆中国人IκBα基因，了解其与欧美人种有无不同, 为进一步的研究工作打下基础。方法从中国人外周血中分离单个核细胞，刺激细胞贴壁30 min后 提取总RNA。应用RT-PCR法扩增目的基因，胶回收法纯化。将其连接到pGEM-T质粒载体，进行测序并与已知IκBα 序列进行同源性分析。结果中国人IκBα基因与genebank中发表的人IκB α基因序列仅2个碱基不同且所编码氨基酸无改变。结论我们已成功克隆了中国人IκBα基因 。同源性分析表明，其与 genebank中所报道的基因序列基本一致。

猪IκBα基因定点突变中两种方法的应用

作者将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸,为进一步研究突变型IκBα蛋白对异种移植延缓性排斥反应的抑制机理奠定基础。首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。说明两种突变方法各有所长,又有各自的缺点,应根据试验的实际需要灵活选择合适的突变方法,以收到事半功倍的效果。

应用巢式PCR法克隆N端部分缺失的IκBα基因

目的 克隆中国人N端部分缺失的IκBα基因 ,为进一步应用其进行抗肿瘤基因治疗研究打下基础。方法 从中国人外周血中分离单核细胞 ,采用多聚赖氨酸贴壁刺激 0 .5h后提取总RNA。应用逆转录PCR法 ,以自行设计的引物扩增全序IκBα基因 ,应用巢式PCR法扩增N端部分缺失的IκBα基因 ,用TA克隆技术将目的基因连接到pGEM T质粒载体中 ,进行测序并与已知IκBα序列进行同源性分析。结果 测序结果表明我们所克隆的目的基因 ,其基因序列与GenBank中人IκBα基因序列仅有 5个碱基不同但所编码氨基酸仅 1个发生改变。结论 已成功克隆了中国人N端部分缺失的IκBα基因 ,为进一步应用N端部分缺失的IκBα基因进行抗肿瘤基因治疗研究打下了基础。

霍奇金淋巴瘤IκBα基因第四外显子突变初步分析

霍奇金淋巴瘤（HL）临床治疗进展很快，但其发病机制仍不清楚。已知HL的发生、发展和核因子-κB（NF—κB）活性异常增高有关。IκBα是NF-κB最主要的抑制因子，IκBα基因异常可能参与HL的发生、发展。经典型HL细胞（HRS细胞）中IκBα第四外显子突变文献报道较少，本组以初发未经治疗的HL为研究对象，分析HL中IκBα第4外显子突变的特点、可能造成的蛋白结构异常及其病理意义。

霍奇金淋巴瘤IκBα基因第5外显子突变初步分析

目的分析单个霍奇金淋巴瘤细胞IκBα基因第5外显子的碱基序列,探讨IκBα基因突变与霍奇金淋巴瘤的关系。方法用免疫组织化学EnVision法检测7例霍奇金淋巴瘤CD30抗原,采用激光显微切割技术捕获CD30阳性表达的单个霍奇金淋巴瘤细胞和其周围反应性增生的淋巴细胞,以这些标本的基因组DNA为模板,用半巢式聚合酶链反应(PCR)方法扩增IκBα基因的第5外显子,PCR产物经纯化后直接测序。结果分析测序图发现3例霍奇金淋巴瘤细胞IκBα第5外显子出现点突变,均形成TGA终止密码子。结论霍奇金淋巴瘤中IκBα基因第5外显子出现点突变,可能是霍奇金淋巴瘤恶性转化过程中除EB病毒感染外另一重要分子机制。

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxAIκBα融合蛋白的制备

目的 利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒 ,制备TrxA IκBα融合蛋白 ,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体。方法 以重组质粒pGEM T IκBα为模板 ,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA ,经相应酶切后插入原核表达载体pET 32a(+)。重组表达质粒pET32a(+) IκBα转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达TrxA IκBα融合蛋白。Westernblot试验鉴定表达蛋白。超声波破菌后采用Ni NTA树脂对TrxA IκBα融合蛋白进行纯化。结果 酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET 32a(+)。重组表达质粒pET32a(+) IκBα在大肠杆菌BL2 1(DE3)中成功地表达了TrxA IκBα融合蛋白 ,其相对分子质量(Mr)约为 5 6× 10 3 ,表达量约占细菌总蛋白的 2 5 %。Westernblot试验显示TrxA IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应。经Ni NTA树脂纯化后 ,TrxA IκBα融合蛋白的纯度可高达 95 %以上。结论 人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础。

人突变型IκBα真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人突变型IκBα真核表达质粒。方法:应用RT-PCR及重叠延伸PCR技术,得到点突变的人IκBαM,并定向克隆至PcDNA3.0真核表达载体,酶切和DNA序列测定鉴定。结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒PcDNA3.0-IκBαM构建正确。结论:真核表达质粒PcDNA3.0-IκBαM构建成功,为进一步研究其生物功能打下基础。