转染IκB激酶2的显性负性突变体的受者树突状细胞诱导产生的CD4＋CD25-T细胞延长肾移植大鼠生存时间的研究

目的 探讨转染Adv-IκB激酶2的显性负性突变体（IKK2dn）基因并负载供者抗原的受者树突状细胞（DC）诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞回输是否延长同种异体肾移植大鼠的存活时间,并探讨其机制.方法 获取和培养受者Lewis大鼠骨髓源性DC,转染IKK2dn基因并负载BN大鼠可溶性抗原,与BN大鼠的T细胞初次混合淋巴细胞反应（MLR）,72 h后采用免疫磁珠分选法筛选CD4＋ CD25-T细胞.肾移植受者为Lewis大鼠,分为初始T细胞组、Adv0-CD4＋T细胞组、CD4＋CD25-T细胞组、排斥组,术前7d分别输注1×107个初始CD4＋T细胞、Adv-0-DC诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞、Adv-IKK2dn-DC诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞和等量生理盐水,供者均为BN大鼠.另设第三方供者组,术前处理同治疗组,供者为Wistar大鼠.移植术后观察各组大鼠存活时间和发生排斥反应;测定受者T淋巴细胞增殖能力;检测血清白细胞介素（IL）-2、IL-10、γ-干扰素（IFN-γ）以及转化生长因子-β（TGF-β）表达水平;监测血肌酐（Cr）水平;病理学检查评定排斥级别.结果 CD4＋ CD25-T细胞组肾移植大鼠生存时间为（28.50 ±2.36）d,较其他各组显著延长（P＜0.01）;与其他各组比较,CD4＋ CD25-T细胞组表达高水平IL-10和TGF-β（P＜0.05）;与排斥组、Adv0-CD4＋T细胞组、第三方供者组比较,CD4＋ CD25-T细胞组低表达IL-2和IFN-γ（P＜0.05）;CD4＋ CD25-T细胞组T淋巴细胞的增殖能力明显低于其他4组（P＜0.05）;病理学检查CD4＋CD25-T细胞组发生排斥反应的病理级别较低.结论 转染IKK2dn基因并负载供者抗原的受者DC诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞回输可以延长同种异体肾移植大鼠生存时间,并具有针对供者的特异性,其机制可能与诱导的IL-10、TGF-β的高分泌有关.

显性负性突变体对AP2α转录因子及其活性的影响

转录蛋白2α(activator protein-2α,AP2α)的转录活性可能是全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)神经分化的关键调控点,但具体机制尚不清楚,显性负性突变是研究基因功能的一个经典手段.以携带AP2α全长基因的pAd-AP2α质粒为模板,分别扩增缺失bHLH及缺失TAD区域的AP2α片段,采用AdEasy腺病毒包装系统获得两种AP2α缺失型显性负性突变体重组腺病毒Ad-dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α-△TAD,腺病毒感染ATRA诱导24 h的大鼠MSCs可观察到60%以上RFP阳性细胞.Real-time-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示AP2α定位于MSCs细胞核,经A-TRA诱导24 h,AP2α的表达无变化,而其下游基因bcl-2及c-kit表达增高,两种缺失型显性负性突变体腺病毒感染MSCs对野生型AP2α的mRNA及蛋白表达没有影响,却能有效抑制AP2α对下游靶基因bcl-2和c-kit的转录激活作用.为进一步研究AP2α转录活性在ATRA诱导MSCs成神经分化中的作用提供重要的分子手段.

AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用

目的构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体,并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE),将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10,通过Realtime PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达,EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞,荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞,荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体,Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体,EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力,而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性,而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高,其中BMP9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性,并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。

AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨

目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△b HLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果:BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、OPN及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的增高(OC:F=56.929,P=0.000;OPN:F=54.789,P=0.000;OPG:F=159.451,P=0.000),ALP活性(F=69.776,P=0.000)及红色钙盐沉积减少。结论:BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。

靶向表皮生长因子受体的肿瘤生物治疗方法研究进展

肿瘤生物治疗(cancer biotherapy)已经成为继手术、放疗和化疗三大经典肿瘤治疗模式后的第四模式。在肿瘤生物治疗中,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶点扮演着重要角色。EGFR为一种相对分子质量为170 000的酪氨酸蛋白激酶型受体,在多种恶性肿瘤存在过表达,在肿瘤发生、发展中起着重要作用。靶向EGFR的肿瘤生物治疗方法主要包括:基因沉默治疗、显性负性治疗、单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)治疗、生物"导弹"治疗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR TKI)治疗、双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)治疗方法等。目前靶向EGFR的肿瘤生物治疗研究已经取得较大进展,随着研究的进一步深入,肿瘤的治疗必将跨入一个全新的时代。