体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。

小檗碱抗流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎性损伤的实验研究

目的观察小檗碱对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达及炎性细胞渗出的影响,探讨其抗炎性损伤作用。方法 BALB/c小鼠108只随机分为正常组、模型组、小檗碱组。模型组和小檗碱组予25μL 50LD50病毒液滴鼻建立流感病毒感染的小鼠肺炎模型,感染后1 h,正常组和模型组予以双蒸水灌胃,小檗碱组每日予药物0.005 g/kg腹腔注射,各组均给药2次/d,连续给药5 d。感染后第2、4、6日分别取材,免疫组化法检测肺组织中ICAM-1、VCAM-1的表达,对肺泡灌洗液(BALF)中白细胞进行分类计数。结果病毒感染后第2、4、6日,模型组肺组织中ICAM-1、VCAM-1的表达明显增强,小檗碱降低了ICAM-1、VCAM-1的表达水平,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);模型组BALF中白细胞总数、单个核细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数均明显升高,小檗碱组第6日BALF中白细胞总数、中性粒细胞数明显降低(P<0.01),第4日时BALF中单个核细胞数降低(P<0.01)。结论小檗碱能够抑制流感病毒性肺炎小鼠肺组织中ICAM-1、VCAM-1表达,减轻了炎性细胞渗出,对小鼠流感病毒性肺炎肺组织炎性损伤具有保护作用。

鸡沙门菌NCTC13346株基因组物理图谱的建立与结构特征的比较

目的建立鸡沙门菌NCTC13346株基因组物理图谱,并比较其结构特征。方法制备鸡沙门菌NCTC13346株基因组DNA,用rrl基因特异性的I-CeuⅠ内切酶以及限制性内切酶XbaⅠ和AvrⅡ酶切后,进行脉冲凝胶电泳(PFGE),分离出DNA片段,最后用噬菌体P22转导已知携带沙门氏菌基因的Tn10插入子的方法定位基因排列,根据酶切片断的连接与已知基因的定位,绘制该菌的基因组结构物理图,并与已知鸡沙门菌SARB21基因组结构进行比较。结果建立鸡沙门菌NCTC13346株基因组物理图谱,与鸡沙门菌SARB21基因组物理图谱相比,两者具有相对于鼠伤寒沙门氏菌LT2的相似的基因插入和缺失片段,但由于两者基因组中含有rrn操纵子的DNA片段的不同排列,分别表现为迥异的基因组结构。结论建立鸡沙门菌基因组物理图谱可用于分析同种细菌的基因组特点与进化。

E.coli临床分离株的基因组结构分型

目的 通过基因组结构分析对临床分离的Escherichiacoli(E .coli)进行分型 ,并探讨分型与临床疾病的关系。方法 取临床不同疾病病人的痰、尿、血、分泌物等标本 ,分离E .coli。用I CeuⅠ酶切全基因组DNA ,用脉冲场凝胶电泳分离DNA片段后 ,根据酶切图谱的异同进行分型。结果从临床上分离的 6 4株E .coli中 ,6 2株有 7个I CeuⅠ酶切位点 ,2株有 8个I CeuⅠ酶切位点。菌株间I CeuⅠ酶切图谱差异明显。这些菌株根据基因组结构的差异分为 32个型 ,分型与疾病之间的对应关系分散。结论 临床分离的E .coli基因组结构存在多样性 ,其与临床疾病之间的关系有待进一步探讨。