用于筛选和评价抑制I型胶原α1链基因表达的抗肝纤维化药物双报告基因系统的构建及其有效性鉴定

目的构建一种双报告基因系统，用于筛选和评价抑制I型胶原α1链基因（COLIAl）表达的抗肝纤维化药物。方法RT-PCR克隆转化生长因子β1（TGFβ1）全长基因，酶切后插入载体pcDNA3．1和pJW4303，构建真核表达载体pcDNA3.1-TGFβ1和pJW4303-TGFβl；以基因组DNA为模板，克隆COLlAl启动子，插入报告基因载体pGL4.29，构建含COLlAl启动子的报告基因载体pGL4.29-COLlAl promoter。上述重组载体鉴定使用酶切和序列测定。将pcDNA3.1-TGFβ1或pJW4303-TGFβ1与pGL4-COLlAl promoter、内参报告基因载体pRL-null共转染入肝星形细胞系LX-2中，构建转录激活的双报告基因系统。使用地塞米松鉴定该双报告基因系统评价抗肝纤维化药物的有效性。组间比较用Studant t检验分析，P〈0.05为差异有统计学意义。结果成功构建TGFβ1的两种真核表达载体和含COLlAl启动子的报告基因载体。通过双报告基因检测两种方式表达TGFβ1对COLlAl启动子活性的影响，结果表明：分泌表达的TGFβ1使cOLlAl启动子活性提高200倍以上（t=21.78，P=0.0001），非分泌表达的TGFβ1仅使cOLlAl启动子活性提高了不到2倍t=3.396，P=0.0274）。成功构建了转录激活的双报告基因系统。用COLlAl表达抑制剂地塞米松作为模式药物来鉴定该系统的有效性，结果显示地塞米松对COLlAl启动子有抑制作用，且呈有剂量依赖性。结论成功构建了用于筛选和评价抑制COLlAl表达的抗肝纤维化药物的双榀告基因系统并答定该系统的有效件．

长春市汉族人群COL1A1启动子区多态性与骨质疏松症的相关性

目的研究长春市汉族人群Ⅰ型胶原α1链基因(COL1A1)启动子区-1997G/T、+1245G/T多态性及其与骨质疏松的关系。方法 (1)抽取受试人群外周静脉血5 ml,提取血清DNA。(2)应用实时荧光定量PCR仪扩增目的基因的DNA片段。(3)采用TaqMan探针法对-1997G/T及+1245G/T位点进行等位基因鉴别。(4)应用双能X线骨密度仪测定骨密度(BMD),将374例受试人群分为骨密度正常、骨质疏松、骨质疏松性骨折3组。结果长春市汉族正常人群COL1A1-1997G/T转换中,GG基因型占38.40%,GT基因型占46.38%,TT基因型占15.22%,以GT基因型为主;骨质疏松患者女性GG等位基因型所占比例大于男性,GG基因型占44.39%,GT基因型占43.37%,TT基因型占12.24%;骨质疏松骨折患者GG基因型为主,占47.50%,GT基因型占35.00%,TT基因型占17.50%。骨质疏松组女性GG基因型BMD低于GT、TT基因型,但差异无统计学意义(P均>0.05);骨质疏松骨折组女性GG基因型BMD显著低于GT、TT基因型(P均<0.05)。COL1A1+1245位点G/T转换,在正常人群中发现GT杂合型2例,占总数的0.53%,其余均为GG基因型。结论 COL1A1-1997G/T转换中正常人群以GT基因型为主,骨质疏松患者和骨质疏松骨折患者以GG基因型为主。骨质疏松患者和骨质疏松性骨折患者女性GG基因型BMD均低于GT、TT基因型。COL1A1-1997G/T与BMD显著相关,+1245G/T与BMD无相关性。

回转对COL1A1-EGFP基因表达的影响

研究微重力对COL1A1(Ⅰ型胶原α1链基因)启动子活性的影响,探讨微重力对成骨细胞相关基因表达影响的作用机制.将长为3.6 kb COL1A1启动子双酶切,获得不同长度的启动子片段,并与报告基因EGFP(增强型绿色荧光蛋白)连接,转染ROS17/2.8细胞,用G418筛选,得到稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株.利用回转器模拟微重力效应,体外培养条件下,观察各细胞株报告基因的表达情况.结果显示细胞在模拟微重力下培养24,48 h后,报告基因EGFP和Ⅰ型胶原的表达升高,表明COL1A1启动子活性增强.说明短期模拟微重力条件下,成骨细胞能通过增强COL1A1启动子活性,代偿性提高Ⅰ型胶原的表达.