MHCⅠ类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达

目的构建BALB/c小鼠MHCⅠ类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中的表达。方法由逆转录病毒载体pMSCV介导,将BALB/c小鼠的H-2Dd基因导入C57BL/6小鼠的造血细胞中,并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定证实,H2Dd基因正确插入载体pMSCV。重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2Dd基因,且能转录为mRNA,在其细胞膜上有H2Dd分子的表达。结论成功构建小鼠H-2Dd编码基因的逆转录病毒载体,该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内,且在细胞中得到表达。

HLA-I类基因新等位基因HLA-B＊52：11的序列分析及确认

目的序列分析及确定1个HLA新等位基因。方法应用基于Luminex平台的聚合酶链式反应序列特异性寡核苷酸探针（polymerasechainreaction—sequencespecificoligonucleotideprobes，PCR—SSOP）基因分型方法、PCR产物测序和基因克隆测序方法，通过软件分析该基因序列及与最相近等位基因的序列差异。结果PCRSSOP结果显示，该样品HI．A—I类基因B位点反应格局出现异常提示；测序结果最终表明其B位点第3外显子序列与所有已知HI。AB等位基因序列均不一致，在所检测的外显子第2、3、4区域中，与序列最相近的等位基因HLA—B＊52：01：01的差异只是在第3外显子产生了nt583C→T一个核苷酸替代，并导致相应的195位密码子由CAC（H）→TAC（Y），氨基酸组成由组氨酸变为酪氨酸。结论经序列分析1个HLA—I类基因的新等位基因被确认．已被世界卫生组织HI。A因子命名委员会正式命名为HLAB＊52：11。

多重耐药大肠埃希菌氨基糖苷类修饰酶与Ⅰ类整合酶基因的研究

目的探讨本地区临床分离多重耐药大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)的氨基糖苷类修饰酶和I类整合子基因存在情况。方法纸片扩散法(K-B法)测定71株大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药性,应用PCR技术对E.coli进行氨基糖苷类修饰酶和I类整合酶基因的检测。结果 71株大肠埃希菌对庆大霉素、左氧氟沙星、头孢噻肟、头孢他啶的耐药率分别分为66.20%、63.38%、59.15%、18.31%,其中23株为多重耐药株(32.39%)。氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-II阳性40株(56.34%),aac(6')-I阳性22株(30.99%),ant(3")-I阳性14株(19.72%),未检出aac(6')-II阳性株,氨基糖苷类修饰酶基因总检出率为74.65%;I类整合酶基因(intI1)阳性53株(74.65%)。多重耐药与非多重耐药大肠埃希菌中aac(3)-II、aac(6')-I、总氨基糖苷类修饰酶基因、intI1的阳性率有统计学差异(P<0.05)。结论本地区多重耐药E.coli的氨基糖苷类修饰酶基因、I类整合酶基因携带率高。

湖南地区HBV患者MHC-I类链相关基因A第五外显子微卫星多态性研究

分别提取湖南汉族人群108例慢性乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)患者、96例HBV携带者和142例健康对照者外周血基因组DNA,利用聚合酶链反应和基因扫描技术分别对它们的主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关A(major histocompatibility complex classⅠchain related A,MICA)基因第5外显子进行微卫星多态性分析;应用DNA测序分析对不同的基因型进行验证,同时应用PCR/SSP技术进行MICA*Del检测,确定MICA基因第5外显子基因型。发现本研究的三组中分别检出A4、A5、A5.1、A6、A9五种等位基因,且以A5和A5.1为主;在HBV携带组和健康对照组中分别检出MICA*Del基因。结果同时显示慢性HBV患者组MICA*A5.1/A9基因型频率、慢性HBV患者组的MICA*A9等位基因频率、慢性HBV患者组MICA*A9表型频率和HBV携带组MICA*A5.1/A9基因型频率均低于相应的健康对照组;而湖南地区汉族人群HBV携带者和慢性HBV患者间的基因型频率、等位基因频率和表型频率无显著性差异;因而推测MICA*A5.1/A9基因型和MICA*A9等位基因可能是抗HBV感染的一种保护性等位基因。为今后进一步研究HBV的感染、预防和治疗提供参考依据。

猪MHCⅠ类区域基因及其分型研究进展

猪MHCⅠ类区域的基因可分为Ia ,Ib及Ic三类基因 ,其中Ia共发现 7个基因 ,Ib为 3个 ,Ic为 2个 ,不同类型的基因有着相似的结构 ,具有不同程度的同源性。对Ⅰ类基因分型 ,血清学分型共得到 74个单倍型 ,分子学分型结果变化较大 ,其中有一个已分为 7个血清学型的Ⅰ类等位基因 ,经特定酶切后确认得到了 7个等位基因的图谱。

猪源粪肠球菌耐药性及其Ⅰ类整合子遗传标记研究

为查明猪源粪肠球菌Ⅰ类整合子遗传标记及其相关耐药性,本研究对新疆某集约化猪场环境和粪便中分离的16株粪肠球菌进行磺胺类药物的敏感性测定和季胺类消毒液抑菌效果观察,同时以PCR法测定分离株中Ⅰ类整合子遗传标记,结果发现16株粪肠球菌中I类整合酶基因阳性率为75%(12/16),qacE△1-sul1基因阳性率为62.5%(10/16),对磺胺嘧啶的耐药率为81.25%(13/16),苯扎溴铵对分离株的抑菌率为31.25%(5/16)。表明分离株中I类整合酶基因和qacE△1-sul1基因携带率高;鉴于整合子对耐药基因水平传播的可能性,磺胺类药物作为预防猪场细菌性疾病的感染以及季胺类(苯扎溴铵)消毒剂作为猪场常规消毒剂需要科学的验证方可使用;同时警示应加强动物性食品源性细菌耐药性的监测,以阻断耐药基因给人的传播。

白血病与尿毒症患者MICA*008基因分析

目的探讨MICA*008基因在白血病与尿毒症患者中的分布。方法应用PCR/SSP的方法检测白血病患者66例,尿毒症患者91例和无血缘关系健康人81例的MICA*008基因。结果白血病患者、尿毒症患者和正常健康人的MICA*008基因频率分别为22.2%,18.8%和34.3%。前两者的基因频率无差异(P>0.05),但均低于后者(P<0.05)。结论白血病和尿毒症患者的MICA*008基因频率均低于正常健康人,但两者之间无差异。

放疗对食管癌患者血清可溶性MI CA含量及外周血NK细胞功能的影响

目的探讨经不同剂量高能X线照射后食管癌患者血清可溶性MHC—I类分子链相关基因A（sMI-CA）含量、自然杀伤细胞（NK细胞）表面NK细胞2族成员D（NKG2D）受体的表达及其杀伤毒性的变化。方法采用ELISA法检测中晚期食管癌患者（n=28）和正常对照（n=21）血清sMICA的含量，并动态分析6例食管癌患者经不同剂量高能X线照射后血清sMICA含量的变化。采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达，胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化。结果与正常对照相比，食管癌患者血清sMICA含量明显升高，但不同放疗剂量对食管癌患者血清sMICA含量无显著影响。食管癌患者外周血阳性表达NKG2D的NK细胞比例与正常对照相比显著降低，同时其细胞毒活性亦明显降低。而且与治疗前相比，40～60Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加，同时其NK细胞毒活性最强。结论放疗对食管癌患者血清sMICA含量无明显影响，但适量放疗可使NK细胞毒活性增强。

MICA抗体与移植肾慢性失功的研究

目的 探讨肾移植术后患者抗主要组织相容性复合物I类相关链A基因（MICA）抗体与移植肾慢性失功的关系.方法 选择了1986年～2005年间在北京友谊医院接受肾移植的38例患者,男性32例,女性6例,年龄24～68岁,血肌酐和尿素氮水平高于正常值.采用MICA抗体流式筛查技术,于2009年7月检测MICA抗体和PRA抗体,38例肾移植患者PRA抗体均为阴性,而后观察一年后的肾功能变化.结果 38例肾移植术后群体反应性抗体阴性但血肌酐和尿素氮高于正常值的患者中有9例MICA抗体阳性,阳性率达23.68%.9例MICA抗体阳性患者均呈现MICA抗体多特异性.29例MICA抗体阴性患者,经过一年的治疗,7例患者肾功能基本恢复,2例患者恢复透析,20例患者肾功能基本未变.MICA抗体阳性的9例患者中有4例患者恢复透析,其MICA抗体均为强阳性;另5例患者肾功能基本未变,其MICA抗体4例为弱阳性,1例为阳性.MICA抗体阳性和MICA抗体阴性患者之间恢复透析的患者间差异有统计学意义（χ2=4.73,P〈0.025）.结论 高滴度MICA抗体是引起移植肾慢性失功的重要因素之一.

嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明耐药的机制研究

目的：检测 I类整合酶基因（intI 1）及 qacE△1-sul1和 sul2基因在耐复方新诺明的嗜麦芽窄食单胞菌中的分布情况，并探讨基因分布与细菌耐药性的关系。方法收集临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌，煮沸法提取总 DNA，采用 PCR法检测 intI 1，qacE△1-sul1和 sul2基因在复方新诺明敏感菌株和耐药菌株中的分布情况。结果28株耐复方新诺明嗜麦芽窄食单胞菌中有25株检出 I类整合酶基因，检出率为89.29％；21株检出 qacE△1-sul1基因，检出率为75％；15株检出sul2基因，检出率为53.57％；18株复方新诺明敏感的嗜麦芽窄食单胞菌中有5株检出 I 类整合酶基因，检出率为27.78％，4株检出 qacE△1-sul1基因，检出率为22.22％，均未检出 sul2基因。结论耐复方新诺明嗜麦芽窄食单胞菌大部分携带有 intI 1，qacE△1-sul1和 sul2基因，嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明的耐药性与 intI 1，qacE△1-sul1和 sul2的存在有关。

主要组织相容性复合体I类链相关基因A基因型在1型糖尿病及其亚型中的分布特点

目的探讨主要组织相容性复合体I类链相关基因A（MICA）基因型在1型糖尿病（T1DM）亚型中的分布特点及其与人类白细胞抗原-DQ（HLA-DQ）基因的关系。方法选取1999年6月至2004年12月在中南大学湘雅二医院内分泌科就诊的无亲缘关系的T1DM患者338例为研究对象，其中1A型糖尿病患者193例（TIADM组）、成人隐匿性自身免疫糖尿病患者145例（LADA组），无亲缘关系的体检健康志愿者258名（健康对照组）。用PCR．直接测序法检测T1DM组、LADA组和正常对照组的MICA和HLA-DQ基因型。根据MICA基因外显子5的跨膜区多态性GCT重复序列的数目，确定为MICA4、5、5．1、6,9共5种等位基因。使用卡方检验比较各组之间MICA基因频率的差异，使用SvejgaardRyder检验分析MICA基因和HLA-DQ基因之间的关系。结果（1）MICA4、MICA9等位基因和MICA4／9、MICA9／9基因型的频率在起病年龄〈20岁的T1ADM组患者较正常对照组增多（分别为20-3％比13．2％、26．8％比13．2％、13．0％比3．5％、6．5％比1．9％，X^2=6．501、21．419、12．312、5．269；均P〈0．05），而MICA5、MICA5．1等位基因和MICA5．1／A5．1基因型较正常对照组频率减少（28．9％比37．8％、19．1％比28．9％、4．9％比10．5％。X^2=5．845、8．323、3．286，均P〈0．05）。（2）MICA基因的频率在起病年龄≥20岁T1ADM组以及LADA组患者与正常对照组差异无统计学意义（分别为X^2=0．067～3．078、X^2=0．000-3．954，均P〉0．05）。（3）MICA与HLA．nq基因无连锁不平衡，SvejgaardRyder检验显示，MICA基因的易感作用较HLA-DQ弱[0R（95％C1）：0．266（0．114-0．625）1，只有HLA-DQ基因为易感基因时，MICA才显示其易感作用[3．037（1．448～6．370）]，而HLA-DQ为保护或中性基因时MICA基因无易感作用（均P〉0．05）。结论MICA基因仅在携带HLA-DQ易感基因的T1ADM患者中起作用，MICA基因多态性与起病年龄〈20岁的T1ADM相关，而与起病年龄≥20岁T1ADM和LADA患者无关。

MICA基因第2～4外显子大规模双向测序及分子克隆检测平台的建立

目的建立稳定的、大规模的MICA基因第2～4外显子双向测序分型检测技术平台，并分析其单核苷酸多态性（single nueleotide polymorphism，SNP）。方法自行设计MICA基因第2～5外显子扩增引物及测序引物，探索PCR扩增及测序的最佳反应条件。用商品化的MICA基因单向测序分型试剂盒作为平行对照，对4个包含MICA＊010等位基因的样本采用自行设计引物扩增，并进行分子克隆和单倍体测序。结果采用自行建立的MICA基因双向测序分型方法验证了100人份平行对照组单向测序分型结果。应用本研究建立的方法获得了中国人群MICA基因第2～4外显子22个SNP位点。两个新等位基因MICA＊065、MICA＊066获得了世界卫生组织的正式命名。首次发现了MICA等位基因第3内含子新的SNP位点，序列已提交IMGT／HLA数据库。结论建立的MICA基因双向测序方法可大规模应用于中国人群的MICA基因多态性、组织器官移植配型和疾病研究。

MICA无效等位基因MICA＊063N核苷酸序列全长分析

目的分析主要组织相容复合物I类相关基因A（majorhistocompatibilitycomplexclassIchain-relatedgeneA，MICA）无效等位基因MICA＊063N的核苷酸序列及探讨其分子基础。方法采用直接测序法（sequence-basedtyping，SBT）对MICA＊063N基因进行多态性分析并应用基因克隆测序法检测其碱基序列，应用测序软件比对MICA分型。结果直接测序法发现该基因序列与MICA＊027类似，在第2外显子编码子62碱基位置184出现信号“Y”，提示该位置出现碱基突变。再以克隆测序法证明，该碱基突变为C—T，在该位置编码子由CAG→TAG，TAG编码终止密码子。由于该等位基因提前出现终止密码子，因此推测可能该基因表达为截短或无效蛋白质。结论MICA＊063N基因序列已提交GenBank，已于2010年10月获世界卫牛组织HLA命名委员会正式命名（编号HWS10011131）。

新等位基因MICA＊065的鉴定及其序列分析

目的 鉴定中国深圳地区人群中新发现的1个主要组织相容复合物Ⅰ类相关基因A位点（MICA）等位基因,并对该新MICA基因的突变情况进行分析.方法 选择2012年1～12月,于深圳市血液中心行组织配型的供、患者中,1例MICA基因分型异常的健康供者作为研究对象.采用自主建立的基于聚合酶链反应-碱基序列直接测序（PCR-SBT）法对本例供者MICA基因第2～5外显子进行测序分型,利用分子克隆和单倍体测序的方法,鉴定出该个体MICA等位基因的序列.利用序列比对方法,对该MICA等位基因的突变情况进行分析.结果 于本例供者血液样品中,检出了1个新变异的MICA等位基因,其序列与MICA＊ 010∶01最为相近,但存在基因组DNA nt 637位点的碱基由胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）,MICA基因第4外显子中的第1 91位密码子由CGC变异为TGC,导致氨基酸由精氨酸变异为半胱氨酸,该序列提交国际GenBank数据库（序列号：JN043370）和国际免疫遗传学信息系统/人类白细胞抗原（IMGT/HLA）数据库（序列号：HWS10013775）,已被命名为MICA＊ 065.结论 新等位基因MICA＊ 065的变异碱基T,是1个全新的随机突变位点,未在MICA其他等位基因中发现.

HBV感染和MICA及TLR10基因多态性与原发性肝癌的关联

目的探究乙型肝炎病毒(HBV)感染、MHC I类链相关基因A(MICA)及Toll样受体10(TLR10)基因多态性与原发性肝癌的关系。方法选取2017年3月-2020年2月福建医科大学莆田市第一医院教学医院收治的原发性肝癌患者137例,根据是否合并HBV感染分为HBV组和非HBV组,采用Taqman荧光探针的基因分型方法检测MICA基因rs2596542、TLR10基因rs10004195及rs11096957位点,流式细胞术检测肝癌组织和肿瘤边缘组织中髓样来源的抑制性细胞(MDSCs),并分析影响原发性肝癌患者预后的影响因素。结果MICA基因rs2596542位点A等位基因和TLR10基因rs10004195位点A等位基因频率在HBV组中的分布高于非HBV组(P<0.05),两组基因型分布有统计学差异(P<0.05)。原发性肝癌患者MDSCs在肝癌组织中比例低于肿瘤边缘组织(P<0.05),且HBV组患者肝癌组织、肿瘤边缘组织中MDSCs比例高于非HBV组(P<0.05)。预后不良患者年龄≥60岁、存在肝癌家族史、临床分期Ⅲ~Ⅳ期及合并HBV感染比例高于预后良好者(P<0.05)。非条件Logistic回归模型分析显示,存在肝癌家族史和合并HBV感染是影响原发性肝癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)。结论MICA基因rs2596542、TLR10基因rs10004195位点基因多态性与原发性肝癌患者HBV感染存在关联,且HBV感染可增加肿瘤局部MDSCs分泌,产生免疫抑制,影响患者预后。

组织相容性抗原(HLA)复合体

人类 HL A复合体位于第 6号染色体的短臂上 ,含有 1 0 0多个基因位点 ,按其产物的结构、组织分布及功能将其分为 3个区域。本文介绍了 3类基因区及编码的产物、遗传特点和实际应用。