CEL I酶的高效检测及其在Eco-TILLING中的高效应用

CEL I酶是Eco-TILLING技术的关键酶。实验采用酶切连接的方法构建了酶切位点上插入突变的质粒,应用该质粒能方便有效地检测CEL I活性。进一步简化CEL I酶的提取方法,并对每一步提取液样品进行活性检测。结果表明,芹菜汁也具有明显的酶切活性,进一步的提纯能提高其活性,琼脂糖凝胶电泳也能获得直观的检测结果,通过简化程序可高效应用于植物Eco-TILLING分析。该研究结果有利于Eco-TILLING技术的广泛使用,对于建立简易而又有效的点突变检测方法具有重要的意义。

猪生长激素基因ApaⅠ酶切位点多态性分析

利用 PCR- RFL P技术 ,分析了大约克猪和长白猪 GH基因的 Apa 酶切位点多态性。结果表明 ,在p GH基因序列中共检测到 5种基因型和 4种等位基因 ;基因型频率和等位基因频率在 2个猪种间分布差异不显著。

人肝β—N—乙酰氨基已糖苷酶同工酶的分离纯化及抗体制备

β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosamin idase, β-NAH,EC3.2.1.52)是一种溶酶体水解酶, 广泛分布于人体各组织中,参与体内糖蛋白及糖脂中糖链的分解代谢。80年代以来,有些研究者用等电聚焦电泳技术研究了血清β-NAH同工酶,由于电泳法只能是定性或半定量的,测定结果误差较大,操作复杂,临床难以推广应用。为了研究β-NAH同工酶在肝病中的临床意义。

利用XcmⅠ构建T载体

目的 :构建能自我复制的T载体。方法 :设计一对引物 ,引入XcmⅠ酶切位点 ,通过PCR方法用PET 2 8(a) +作模板扩增5 5 0bp ,插入Pa载体后用限制性内切酶、PCR及DNA测序等方法作鉴定。结果 :用XcmⅠ酶切可见 5 40bp及 3810bp双酶切条带 ,用此载体作模板可扩增出 5 5 0bp片段 ,测序结果与预期序列一致。结论 :带有两个XcmⅠ位点的环状载体被成功构建。

线粒体DNA的PCR-RFLP分型法医学应用研究

目的建立PCR RFLP技术检测mtDNA序列多态性的方法,调查武汉汉族人群mtDNAHVⅠ区段限制性片段长度多态性,并对PCR RFLP技术在毛干、指甲等生物检材的个体识别案件中的应用进行评估。方法应用nest PCR技术和RFLP技术建立检测mtDNAHVⅠ区段限制性片段长度多态性的方法,调查150例武汉汉族人群无关个体,同时对实际案件中的毛干、陈旧骨骼、水浸血痕等不同种类、不同保存时间和条件的生物检材进行检测。结果RsaⅠ酶切检出4种表型,频率分别为0.760、0.167、0.066和0.007,遗传差异度(GD值)为0.393,随机匹配概率(P值)为0.607。应用PCR RFLP对毛干、20年陈旧骨骼、水浸血痕进行了检测以及在个体识别及母子关系亲子鉴定案例中应用。结论用PCR RFLP法检测mtDNA序列多态性在法医物证检验中具有应用价值。

DNA甲基化敏感位点(CCGG)文库克隆载体的构建

目的:旨在建立一种简便易行的DNA甲基化文库构建载体,用于筛选细胞中具有甲基化敏感性CCGG位点的DNA片段。方法:根据HpaⅡ/MspⅠ酶切体系对甲基化酶敏感性不同的特点,通过在PCR引物中添加CCGG酶切位点的方法,将扩增得到的目的片段连接到无CpG甲基化的质粒载体上。结果:成功构建了含双CCGG位点的pCpGfree-HpaⅡ/MspⅠ-1质粒载体。结论:所构建的pCpGfree-HpaⅡ/MspⅠ-1质粒载体CCGG位点未发生甲基化,故可以用于构建含有甲基化CCGG序列的DNA甲基化文库。