基于eDNA技术的舟山近海中国团扇鳐定性与定量分析

为探讨环境DNA (environmental DNA, eDNA)技术用于中国团扇鳐监测方面的可行性,同时开展基于eDNA技术的舟山近海中国团扇鳐定性与定量分析。本实验将中国团扇鳐与其同属汤氏团扇鳐COI基因片段序列进行比较分析,使用Primer Express 3.0软件设计中国团扇鳐特异性引物与Taq Man探针。在舟山朱家尖近海设计了A、B、C共3个定置网调查站位,定期收集中国团扇鳐样品。于2017年12月19日、2018年4月13日和2018年7月14日分别采集水样(站位A、B1、B2、C1、C2、D),开展eDNA微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测,并将检测结果与水温和采样点进行差异显著性分析。结果显示,不同站位、不同时间的中国团扇鳐eDNA浓度不同,水样采集点对中国团扇鳐eDNA浓度的影响极显著,不同采样点eDNA在不同季节存在极显著差异。研究表明,eDNA检测技术灵敏度高,水温、底质和水深对中国团扇鳐的分布皆有影响。研究结果为其他海域的中国团扇鳐e DNA追踪监测奠定了基础。

基于毛细管凝胶电泳与DNA条形码技术鉴别可食用动物内脏掺假方法的研究

建立并优化了使用基于DNA条形码技术对可食用内脏制品中包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、兔7种常见动物源成分进行掺假鉴别的方法。用生理盐水清洗和真空冷冻干燥预处理后的内脏样品,经DNA提取扩增后,扩增产物经毛细管凝胶电泳分析系统进行确认,克隆测序结果提交本地数据库Viscera进行比对,同时筛选出适合7种动物源内脏DNA扩增的通用引物COI-A,优化DNA模板量和退火温度,验证考察了19个可食用内脏掺假模型的最低掺假比例。7种动物的5类内脏的PCR扩增效率均为100%,最佳的DNA模板量和退火温度为2μL和53℃,掺假成分的最低检出比例为5%。本方法灵敏度高,可靠性好,可作为常见可食用动物内脏掺假的有效检测方法。

DNA条形码技术在食用血制品掺杂成分鉴别中的应用

目的:建立一种可食用血制品中7种动物源成分(包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、兔)掺杂鉴别的分析方法。方法:血制品经DNA提取纯化及PCR扩增后,将克隆测序结果提交至7种血制品的DNA条形码本地数据库进行序列比对。对血制品的预处理方式、DNA提取方式以及PCR扩增条件进行选择和优化,并建立常见血制品掺杂模型,研究模型的最低掺杂检出率。结果:7种可食用血制品的DNA扩增效率为100%,各种掺杂模型中的最低掺杂检出率为5%;利用该法对25批次市售可食用血制品进行掺杂鉴定,发现有21批次存在掺有其他动物源成分的情况。结论:该方法简单、可靠,可作为日常可食用血制品质量监督的检测方法。

DNA甲基化年龄预测研究进展

衰老是生物体多个器官、组织和细胞功能下降的一个过程,与衰老相关的疾病会在衰老过程中逐渐出现,同时伴随着表观遗传学机制的变化。相关领域的研究也表明,表观遗传学机制的变化过程与生物学年龄的增长密切相关。随着全球老龄化现象的加剧,抗衰老逐渐成为一个备受关注的研究方向,然而衰老过程的表观遗传学表征、机理和定量分析方式仍然需要深入研究。该文对当前基于DNA甲基化的衰老与年龄预测的领域研究进展进行梳理,介绍表观遗传时钟、生物时钟和DNA甲基化的基本原理,以及相应表观遗传时钟的典型研究方法和有效样本资源,并深入讨论该领域研究存在的挑战及发展趋势,旨在为研究者提供全面的参考,促进抗衰老相关临床实践和大健康应用的发展。

基于核酸外切酶Exo I的DNA折纸结构纯化方法

基于核酸外切酶(Exo I)选择性降解单链DNA的性质,为增加DNA折纸结构纯化方法的多样性,开发了一种快速除去剩余DNA单链、纯化DNA折纸结构的新方法。以三角形和矩形DNA折纸结构为研究对象,对缓冲液环境、酶用量、反应温度、反应时间等实验条件进行了优化,采用琼脂糖凝胶电泳方法与原子力显微技术对产物进行分析与表征。结果表明,该方法可以达到快速除去DNA单链、纯化DNA折纸结构的目的,Exo I酶处理不影响DNA折纸结构的完整性及后续的应用开发。

基于COI基因的赣北地区小泡巨鼠的鉴定

目的以线粒体细胞色素C氧化酶亚基(COI)基因为目的基因,利用DNA条形码技术对未知鼠样本进行鉴定.方法采用夹夜法对九江市武宁县宋溪镇某村的鼠密度进行调查,经形态学初步鉴定后,以捕获的1只无法明确鉴定的大型鼠样本为对象,提取基因组DNA并采用COI基因通用引物BatL5310和R6036R进行PCR扩增及测序,将测序结果在NCBI网站进行BLAST比对,采用MEGA7软件选择最大似然法构建系统发育树.结果共捕获小型兽类7只,密度为3.38%,经形态学鉴定有褐家鼠2只,黑线姬鼠2只,臭鼩鼱2只,形态学初步鉴定为青毛巨鼠或小泡巨鼠的未知鼠1只,提取的未知鼠样本DNA通过PCR成功扩增出COI基因目的条带,与NCBI基因库中小泡巨鼠(KP995219)序列同源性高达100%,系统发育树显示该鼠样本与小泡巨鼠(KP995219、KP995203)处于同一分支,遗传距离分别为0、0.0016,而青毛巨鼠(NC_036730)单独处于另一分支,遗传距离较远.结论赣北地区首次报道小泡巨鼠,采用COI基因的DNA条形码技术可快速、准确的进行鼠种鉴定,有助于弥补非常见鼠形态学鉴定困难的不足.

DNA条形码识别 Ⅲ.媒介蚊类DNA条形码芯片的初步研究

目的利用DNA条形码信息研制DNA芯片,建立快速高效的医学媒介蚊类鉴定方法。方法以蚊科5属15种,共30个样本为研究材料,获取其DNA条形码信息(COⅠ基因片段序列),采用基因块motif技术,搜索15个样本的同源保守基因序列,制作虚拟DNA条形码芯片。虚拟电子杂交30个样本,应用软件Bio-Edit计算属、种及种内个体间的同一性,应用phylip3.66软件以最大简约法分别对杂交结果和原序列进行聚类分析比较。结果选择78个DNA片段制作一张虚拟DNA条形码芯片,计算属间的平均同一性为0.75,同一属内种间的平均同一性为0.84,种内个体间的平均同一性为0.98,聚类分析结果一致。结论研制的虚拟DNA芯片能够鉴定本研究中的15种蚊虫,利用DNA条形码信息,设计DNA芯片在理论上可行。

基于COI序列快速鉴定花蓟马的DNA条形码芯片初探

利用DNA条形码信息研制DNA芯片,建立快速高效的花蓟马鉴定方法。以3种花蓟马属,共9个样本的COI基因片段序列为研究材料,应用软件Primer Premier5搜索出9个样本的12种motif基因序列,应用这12种motif序列制作虚拟DNA条形码芯片。虚拟电子杂交20个样本的COI基因片段序列。结果显示,设计的虚拟DNA芯片能够鉴定本研究中的3种花蓟马,利用DNACOI基因片段,设计DNA芯片在理论上可行。

基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR建立生乳及乳制品沙门氏菌快速检测技术

生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。

基于线粒体CO1基因的DNA条形码在石首鱼科(Sciaenidae)鱼类系统分类中的应用

采用CO1基因特异扩增测序及与GenBank已有序列联配分析的方法,进行了石首鱼科19属30种鱼类75个CO1基因片段的序列比较和系统进化研究,结果表明,石首鱼科鱼类该片段的平均GC含量为48.3%,其中第2密码子位点含量最高(51%-58.4%,平均56.6%),第1密码子变化范围最大(27.6%-54.1%,平均44.9%),第3密码子差别较小(41.6%-43.6%,平均42.7%)。依据Kimura-2-parameter模型,30种石首鱼科鱼类种内遗传距离平均值为0.006,种间为0.210,种间遗传距离是种内的35倍;在分子系统树上,28个种(93.3%)可形成单系,18个属(94.7%)可聚为独立的分支;与形态学分类不同的是,由黑鳃梅童鱼(Collichthys lucidus)与棘头梅童鱼(C.niveatus)的遗传距离(0.004)推断二者遗传变异尚未达到种的分化水平,灰鳍彭纳石首鱼(Pennahia anea)与白姑鱼(Argyrosomus argentatus)的形态学特征相似性和条形码序列同源性都提示二者可能为同种异名,而红牙(Otolithes ruber)印度洋和南海两个地理群体间的遗传分化已经达到种的水平。本研究证明线粒体CO1基因可作为DNA条形码对石首鱼科鱼类进行有效的物种鉴定,亦可用于探讨石首鱼科的属、种分类单元系统发育问题。

基于COⅠ的中国西施舌DNA条形码

以我国大连(DL)、日照(RZ)、启东(QD)、长乐(CL)、漳州(ZZ)和北海(BH)6个野生群体西施舌为研究对象,用引物LCO1490和HCO2198扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因片段序列,PCR产物双向测序,用ClustalX进行DNA序列比对,用MEGA4.1和PhyML软件构建NJ树和ML树,用Arlequin3.11软件进行分子方差分析,研究COⅠ这一特定基因区段作为DNA条形码在识别西施舌地理群体的可行性和有效性。结果获得658bp的COⅠ核苷酸片段,其T、C、A、G含量分别为42.4%、14.8%、21.8%、21.0%,A+T(64.2%)含量明显高于G+C含量。变异位点占15.3%(101/658),其中简约信息位点占14.1%。群体内遗传距离为0.0020～0.0043,群体间遗传距离为0.0024～0.0883。群体间氨基酸序列无变异。长乐、漳州群体(DH组)与其他群体(HB组)间有显著的遗传分化(FST=0.956～0.970)。NJ树和ML树显示长乐、漳州群体聚为一支,北方的大连、日照、启东群体和南方的北海群体聚为置信度较高的另一支(BPN=99),2支间的遗传距离为0.0837,是2支内群体间遗传距离的17.8～23.5倍。本研究结果表明,COⅠ基因片段序列作为鉴定福建西施舌条形码是可行的,但不能将其余群体区别开来。

山东近海习见鱼类DNA条形码及其电子芯片分析

从GenBank下载到13目50科73属77种山东近海鱼类的线粒体细胞色素c氧化酶I(CO I)序列,通过分析其遗传距离及系统进化,并基于CO I序列筛选物种特异性探针来分析DNA芯片技术在进行物种鉴定时的可行性。结果表明,在CO I基因DNA条形码的分析中,77种鱼类的种间遗传距离(平均0.117)明显大于种内遗传距离(平均0.0034),且每个物种的不同个体在进化树上都能聚在一起,提示DNA条形码能全部区分77个物种;根据CO I基因设计的用于芯片的特异性探针中,77个物种最终有64个可以筛选出物种特异性探针,占总物种数的83.1%,本研究旨在为山东近海鱼类物种鉴定提供了技术支持。

DNA条形码识别Ⅰ.DNA条形码研究进展及应用前景

DNA条形码(DNA Barcoding)是近年来生物分类学中引人注目的发展热点。本文综述了DNA条形码的发展历史、识别原理以及公共数据库,并讨论了DNA条形码在检疫检验领域的应用前景。DNA条形码与DNA芯片技术的结合,将推动传统物种鉴定方法的更新,可在检疫检验领域中实现非专家检定,这对进出口口岸生物监测具有重要的理论意义和应用价值。

MEST/PEG1对绒毛外滋养层细胞侵袭和迁移能力的影响及其在子痫前期中的意义

目的:通过研究人中胚层特异性转录基因(mesoderm-specific transcript,MEST)对人绒毛滋养细胞迁移和侵袭等生物学功能的影响,探讨其在子痫前期(preeclampsia,PE)中发病的机制。方法:用免疫组化法和Western blot法检测正常和PE患者胎盘中MEST及DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的表达。并检测2组胎盘中MEST甲基化水平。用Western blot法检测缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)和MEST si RNA处理人滋养细胞株HTR8/Svneo后缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)及MEST表达水平;并检测si RNA转染后对各组细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:MEST在正常胎盘中的表达(4.524±0.586)明显高于PE胎盘(2.640±0.334)且在PE胎盘中处于高甲基化状态。H/R后HIF1α表达明显升高(3.692±0.441,7.091±0.698),而MEST表达明显降低(4.856±0.169,2.205±0.318),特异性敲低MEST后HTR-8细胞侵袭和迁移能力均明显下降(1.057±0.061,0.551±0.029)(1.113±0.087,0.477±0.034),差异均有统计学意义(P<0.05);而增殖能力无明显影响(0.170±0.010,0.158±0.010)(P>0.05)。结论:推测MEST DNA甲基化异常可能影响滋养细胞的迁移和侵袭,从而参与子痫前期的发病。

LZF-Ⅰ探针及草鱼等三种鱼类的DNA指纹图的初步研究(英文)

研究鲤鱼,草鱼和鲢鱼等三种鱼类DNA指纹图的结果是;在大于4kb的谱带中,草鱼为15条,鲤鱼11条,鲢鱼仅3条.我们自己制备的LZF—I探针,能与鱼类基因组DNA中的简单重复序列杂交形成杂交分子.据分子杂交原理知,三种鱼类基因组DNA中存在同源DNA片段,同时,草鱼和鲤鱼间的亲缘关系较草鱼和鲢鱼间的关系近.

COⅠ条形码辅助分析雷州半岛红树林区鱼类的物种多样性

于2014年3月至2015年7月从我国雷州半岛红树林区采集成鱼和幼鱼样本共1720尾,在依据Fish Base等鱼类形态分类系统进行鉴定的基础上,利用COⅠ条形码技术确认存在94个物种,分属11目33科72属。结果表明:红树林区鱼类种群极其丰富,其中鲈形目(Perciformes)鱼类物种最多,为59种,占总物种数的62.77%,其次是鲱形目(Clupeiformes)和鲻形目(Mugiliformes),分别占6.38%和5.32%。鲈形目中又以虾虎鱼科(Gobiidae)为优势类群,含29种(占30.85%)。按生态类群分:海洋洄游鱼类最多,占物种总数的32.98%,其次为海洋偶见鱼类、两侧洄游鱼类,分别占22.34%、17.02%,以虾虎鱼类物种为主的红树林定居鱼类约占11%。本研究表明红树林生态系统是许多海水、淡水和洄游性鱼类在特定生活阶段的重要栖息地和育幼场所。另外,COⅠ条形码技术可有效快捷地鉴定出红树林海域的鱼类。

海参DNA条形码的构建及应用

为研究线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因作为DNA条形码鉴定海参品种的可行性,本实验采集了7种海参(Holothuroidea)43个个体并获得其线粒体COⅠ基因序列,利用DNAstar、DNAMAN和MEGA 4.1软件分析计算了7种海参的碱基组成以及不同海参之间的种间遗传距离和种内遗传距离,利用邻接法和最大简约法分别构建了分子系统树。结果表明,海参的种间遗传距离显著大于种内遗传距离,不同海参在系统树中分别形成各自独立的分支,表明以COⅠ作为海参DNA条形码进行品种鉴定具有一定的可行性。在建立海参DNA条形码的基础上,设计了针对仿刺参(Apostichopus japonicas)的特异性探针。对4种海参(仿刺参Apostichopus japonicas、冰岛参Cucumaria frondosa、加州拟刺参Parastichopus californicus及梅花参Thelenota ananas)进行斑点杂交实验,结果显示,该探针具有较好的特异性和较高的灵敏度,能够实现对仿刺参的鉴定。本研究为后续开展斑点杂交及基因芯片法鉴定海参种类的研究奠定了理论基础。

商陆多糖I对小鼠淋巴细胞DNA多聚酶α活性的影响

本实验在建立ＤＮＡ多聚酶α活性测定方法的基础上观察了商陆多糖Ｉ（ＰＡＰ－Ｉ）对小鼠淋巴细胞增殖及淋巴细胞ＤＮＡ多聚酶α活性的影响。采用［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法和模板活化法（［３Ｈ］－ｄＴＴＰ掺入法）分别检测ＰＡＰ－Ｉ给药组及对照组小鼠淋巴细胞增殖能力和淋巴细胞ＤＮＡ多聚酶α活性。体外实验发现ＰＡＰ－Ｉ显著增强ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖及其ＤＮＡ多聚酶α的活性；小鼠腹腔注射ＰＡＰ－Ｉ（每周１次）对脾淋巴细胞ＤＮＡ多聚酶α活性基本上无影响，但加入ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激后，ＰＡＰ－Ｉ１０ｍｇ／ｋｇ剂量组ＤＮＡ多聚酶α活性显著增强。结果提示ＰＡＰ－Ｉ增强ＤＮＡ多聚酶α活性可能是促进脾淋巴细胞增殖、增强免疫功能的机制之一。

基于mtDNA COⅠ基因的DNA条形码技术鉴定鞘翅目幼虫

传统的形态学分类很难鉴定昆虫的蛹和幼虫。鞘翅目是昆虫纲中最大的类群,其种群鉴定工作复杂而艰巨。为了鉴定形态相似的鞘翅目昆虫的幼虫,本研究利用PCR扩增技术获取青海20个常见鞘翅目幼虫mtDNA上COⅠ基因的566 bp序列,结合Blast搜索、遗传距离计算和NJ系统发育树构建对其进行分类鉴定,有效鉴定出20只供试鞘翅目幼虫属于5科9属。研究结果表明,DNA条形码技术进行种类鉴定快捷、准确,mtDNA COⅠ基因能够用于鞘翅目昆虫分类鉴定。

温度胁迫及恢复过程中褐牙鲆幼鱼GH、IGF-I、RNA/DNA比值和糖原的变化

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼分别在温度8.5℃(T8.5)、13.0℃(T13.0)、17.5℃(T17.5)、22.0℃(T22.0)、26.5℃(T26.5)下养殖10 d后,调整至生长最快的温度22.0℃养殖30 d,研究了生长激素(GH)、类胰岛素生长因子I(IGF-I)、RNA/DNA比值和糖原质量分数的变化。除在胁迫阶段T17.5处理血浆IGF-I质量浓度显著低于T22.0处理外,不同处理的血浆GH和IGF-I质量浓度在胁迫和恢复阶段均无显著差异。不同处理的肝脏RNA/DNA比值仅在20～40 d阶段有显著差异,不同处理的肌肉RNA/DNA比值在所有时间均无显著差异。胁迫结束时T8.5、T13.0、T26.5处理的肝脏糖原质量分数显著低于T17.5处理,试验结束时T22.0处理肝糖原质量分数略低于其余处理。胁迫结束时T26.5处理肌肉糖原质量分数最高,而在恢复的第一个10 d时T13.0处理肌肉糖原质量分数最高。不同温度下养殖10 d导致的生长减缓能够在恢复至22.0℃后的30 d内获得完全补偿生长,但此试验中GH、IGF-I和RNA/DNA比值与生长率不存在明显的相关性。