核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48．5的定位研究

细胞连接蛋白是由多基因家族编码的一类结构相似、分子质量不同的蛋白质.在细胞膜上,每6个相同或不同的连接蛋白围绕中央孔排列形成一个连接子,相邻细胞膜上的连接子相互对接形成细胞间隙连接,细胞间隙连接是一种重要的通讯连接,它不仅是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,而且可以通过介导与细胞的迁移、分化、增生和器官形成有关的信号物质而在胚胎发育中起重要作用.为了进一步探讨细胞间隙连接在生物体中的作用,采用斑马鱼胚胎显微注射核酸酶I-SceI和质粒DNA的方法成功构建了绿色荧光蛋白GFP与细胞连接蛋白Connexin48.5融合表达的转基因荧光斑马鱼品系,并通过对荧光蛋白发光的观察在斑马鱼鱼体中进行连接蛋白Connexin48.5的定位.实验结果表明:核酸酶I-SceI介导下的斑马鱼转基因方法效率较高,可行性好;连接蛋白Connexin48.5在斑马鱼体内主要定位于眼球晶状体和脊索.所获得的Connexin48.5-GFP融合表达斑马鱼系,以及利用该品系进行的Connexin48.5定位研究对细胞连接蛋白在生物体内的功能研究将具有重要作用.

在东方拟无枝酸菌中建立I-SceI内切酶介导的无标记敲除系统

目的在东方拟无枝酸菌中建立由I-Sce I介导的无标记高效重组系统。方法首先构建可用于东方拟无枝酸菌的I-Sce I操作盒,通过敲除多烯类化合物ECO-0501合成相关基因hem A2,比较操作盒使用前后获得hem A2基因双交换突变株的效率。结果在没有引入I-Sce I的情况下,随机重组的发生几率仅约2%,而导入后,由于I-Sce I酶对引入DNA位点的双链切割,导致双交换重组的发生率提高至90%以上。结论 I-Sce I系统是一种可用于东方拟无枝酸菌无标记遗传操作的有效工具。

巨核酸酶I-SceI转基因元件的构建及其在斑马鱼中转基因效率的评估

巨核酸酶I-SceI是由酿酒酵母线粒体中核糖体大亚基上的Ⅰ型内含子编码的一种核酸内切酶,近年已被应用于转基因研究中。I-SceI介导的转基因大多是将I-SceI蛋白和带有其识别位点的质粒共注射于动物的受精卵,但注射酶蛋白前期处理耗时长且工作量大,直接用I-SceI的mR NA代替蛋白进行注射更为简捷。本研究应用I-SceI mR NA介导荧光蛋白基因在斑马鱼中的转植,进一步了解其转基因效率。首先设计合成带有巨核酸酶I-SceI编码序列的辅助质粒(pC S2-I-SceI),并分别构建了带有巨核酸酶I-SceI识别位点、EF1α启动子和荧光蛋白基因(eG FP/RFP)编码序列的供体质粒pI-SceI-EF1α-eG FP/RFP。辅助质粒pC S2-I-SceI体外转录成mR NA,以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL的I-SceI巨核酸酶mR NA共注射到斑马鱼(Danio rerio)受精卵中,注射后48 h的斑马鱼eG FP的平均荧光表达率可达75.86%。在斑马鱼的头部、躯干到尾部均可观察到荧光蛋白的表达,且随着胚胎发育,荧光信号逐渐增强。结果表明I-SceI系统在斑马鱼中可介导较高效率的转植,具有在经济鱼类转基因研究中应用的潜力。

通过归位内切酶引起的donor质粒胞内线性化可提高TALEN介导的同源重组效率

TALEN是一种常用的细胞基因组修饰工具。然而,目前TALEN技术介导的基因敲入效率较低,对提高TALEN介导基因敲入效率的方法进行了摸索。通过在Donor质粒引入Ⅰ-SceⅠ酶切位点,并将Donor质粒、表达Ⅰ-SceⅠ的质粒及TALEN质粒对共转染,引发Donor质粒细胞内线性化。在以基因PC为靶位点时,经Ⅰ-SceⅠ胞内线性化的donor质粒基因成功定点插入的效率比不经过Ⅰ-SceⅠ胞内线性化的质粒提高300%。在另一个基因BSG的TALEN基因敲入系统中,这一效率提高200%。结果表明,Ⅰ-SceⅠ介导的donor质粒胞内线性化可提高TALEN knock in系统的同源重组效率。

大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法

目的:优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法:以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,优化无痕敲除时同源DNA长度与诱导用于筛选阳性克隆I-SceI表达的诱导剂浓度。通过比较敲除nanKETA基因前后菌株的生长曲线,研究大肠杆菌CLM37缺失nanKETA基因后的生长状态。结果:成功无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,并在无痕化处理时,通过延长与基因组同源DNA的长度,由通常使用的80碱基对延长到684碱基对;并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度,由500μg/ml提高到1000μg/ml后,使无痕敲除效率高达90%以上。生长曲线研究表明,缺失nanKETA基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。结论:通过延长与基因组同源的双链核苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度可显著提高无痕敲除的效率。

I-Sce I系统的建立及其在诱导肝癌细胞DNA双链断裂中的应用

目的建立I—Sce I系统并应用该系统制备DNA双链断裂（DSB）的HepG2细胞模型，为进一步研究DSB与HBVDNA整合奠定基础。方法通过分子克隆技术构建携带I—Sce I内切酶识别序列的pEGFP。真核表达载体，并将其转染入肝癌细胞株HepG2，经G418筛选出稳定转染株，随后瞬时转染表达归位内切酶I—Sce I的质粒pCMV-3NSL-I-Sce I。24h后采用免疫荧光法和Western blot检测DNA双链损伤效应分子Y—H2AX的表达，了解DSB情况。结果酶切鉴定和测序证实pEGFP。构建成功；I-Sce I系统引入后HepG2细胞中的γ-H2AX表达明显上调，提示DSB细胞模型构建成功。结论I-Sce I系统能够成功地诱导HepG2细胞株基因组发生DSB，该系统有望为进一步探讨DSB是否为HBV整合的潜在靶位提供有效的研究工具。