抗人iASPP单克隆抗体的制备及研究应用

脾脏内注射iASPP-SV真核表达质粒免疫Balb/c小鼠3 d后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(NS1)进行常规融合。应用原核表达的iASPP-SV全长及iASPP-SV片段His-tag融合蛋白进行间接酶联免疫吸附方法筛选阳性克隆,并对亚克隆后的阳性杂交瘤细胞株所制备的腹水进行了初步生物学特性鉴定。结果获得了6株可稳定分泌特异性抗人癌蛋白iASPP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并可以应用于Western Blot、免疫组织化学等实验。因此,本研究成功制备了抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体。

iASPP和ASPP2在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床特征的关系

目的:检测人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中P53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of P53,ASPP)家族的iASPP、ASPP2以及P53蛋白的表达,并探讨iASPP、ASPP2表达与P53蛋白表达及NSCLC临床病理特征的关系。方法:收集2005年1月至2005年12月贵阳医学院附属医院NSCLC术后的新鲜肺癌组织54例、癌组织边缘2cm以外的癌旁组织44例用于研究。采用免疫组织化学与Western blotting方法检测肺癌组织、癌旁组织中iASPP、ASPP2和P53的表达情况;比较iASPP、ASPP2在肺癌组织与癌旁组织中表达的差异,并分析其与P53表达及临床病理特征的相关性。结果:P53阴性时,NSCLC组织中iASPP蛋白表达阳性率为71.4%,显著高于癌旁组织的21.7%(P=0.001),NSCLC组织与癌旁组织中ASPP2蛋白表达率的差异无统计学意义;NSCLC组织iASPP表达水平显著高于癌旁组织[(0.57±0.36)vs(0.28±0.24),P=0.001],ASPP2表达水平在癌组织与癌旁组织中差异无统计学意义。P53阳性时,癌组织、癌旁组织中的iASPP、ASPP2蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。P53阴性时癌组织中iASPP蛋白的表达显著高于P53阳性组织中的表达(P<0.05),P53阴性时癌组织中ASPP2蛋白表达与P53阳性组织中表达的差异无统计学意义。不同性别、年龄、病理类型、病理分级、临床分期的iASPP、ASPP2蛋白表达差异无统计学意义。结论:人NSCLC组织中iASPP表达与P53表达状态有关,P53阴性时iASPP高表达。iASPP、ASPP2蛋白表达与NSCLC临床病理特征无明显相关性。

iASPP和caspase-9在食管癌组织中的表达及临床意义

目的探讨p53凋亡刺激蛋白家族抑制成员(iASPP)和caspase-9在食管癌中表达与食管癌临床病理特征的关系。方法收集临床食管癌标本85例及30例癌旁正常组织,采用免疫组织化学SP染色法和反转录PCR(RT-PCR)法检测iASPP和caspase-9在食管癌组织和癌旁正常组织中蛋白和mRNA表达情况,分析iASPP和caspase-9表达与食管癌临床病理特征之间的相关性。结果 SP法染色显示iASPP在食管癌组织和正常组织中的阳性表达率分别为72.9%(62/85)、16.7%(5/30),caspase-9在食管癌组织和正常组织中的阳性表达率分别为18.8%(16/85)、76.7%(23/30),二者差异均具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR显示在食管癌中iASPP高表达和caspase-9低表达与食管癌的浸润深度、淋巴结转移、临床TNM分期相关(P<0.05),而与食管癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织类型均无相关性(P>0.05),在食管癌组织中,iASPP和caspase-9的表达呈负相关(P<0.05)。结论 iASPP和caspase-9在食管癌中的不同表达与食管癌的浸润深度、淋巴结转移、临床TNM分期显著相关,且二者呈负相关。

人iASPP全长CDS的分段扩增、克隆及鉴定

目的最初报道的iASPP长度为351个氨基酸,但最近发现iASPP的全长应为828个氨基酸,为了探讨全长iASPP的功能,我们采取3分段扩增的策略克隆全长iASPP基因。方法从HL-60细胞中提取总RNA、DNA,RT-PCR分段扩增目的基因,克隆至pMD19-Tsimple载体,测序,并亚克隆至pCDNA3.1载体。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP经测序,与GenBank上登陆的人iASPP cDNA(gi:60457962)序列完全一致。结论成功构建了iASPP真核表达载体。

iASPP对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响

目的:P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族成员能够调节P53诱导的细胞凋亡。其中ASPP家族抑制成员(iASPP)主要通过特异性地和P53蛋白结合抑制肿瘤细胞的凋亡,本实验通过构建iASPP的RNAi质粒,研究在体内外抑制iASPP基因后对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响。方法:采用分子生物学方法构建iASPP的腺病毒RNAi质粒pAd-iASPP-RNAi;体外转染MCF-7细胞,同时建立MCF-7细胞的裸鼠移植瘤模型;分别采用RT-PCR和Western blotting检测转染后瘤细胞iASPP mRNA和蛋白质表达的变化;采用流式细胞术检测转染前后瘤细胞凋亡的变化。结果:转染iASPPRNAi后,MCF-7细胞的iASPP mRNA及蛋白表达量降低(抑制率分别为95.4%和96.8%,P<0.01);MCF-7细胞的凋亡百分率、坏死百分率与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。裸鼠移植瘤模型经pAd-iASPP-RNAi处理后,iASPP mRNA及蛋白表达量也明显降低(抑制率分别为87.4%和89.2%,P<0.01);移植瘤细胞的凋亡百分率和坏死百分率显著上升(P<0.01和P<0.05)。结论:在体内外抑制iASPP基因的表达能够通过p53途径诱导表达野生型p53的乳腺癌细胞凋亡。

乳腺癌细胞过表达iASPP对顺铂作用的影响

目的构建过表达iASPP的乳腺癌细胞株,分析过表达iASPP对顺铂(cis-dichlorodiamine platinum,DDP)作用下乳腺癌细胞的影响。方法采用RT-PCR方法在乳腺组织中扩增出iASPP,转染入MCF-7,G418筛选获得过表达iASPP的乳腺癌细胞株,MTT和流式细胞仪分析过表达iASPP的乳腺癌细胞株在DDP作用下增殖和凋亡情况。结果成功构建了过表达iASPP的乳腺癌细胞株,过表达iASPP可明显降低DDP对乳腺癌细胞增殖的抑制作用(P<0.01),并降低细胞凋亡的百分数(P<0.01)。结论过表达iASPP可以明显降低乳腺癌细胞MCF-7对DDP作用的敏感性。

iASPP干扰RNA促进肝癌细胞凋亡发生的实验研究

目的:观察iASPP基因干扰RNA转染肝癌细胞SMMC-7721后的干扰效果及细胞凋亡的变化。方法:设计特异性siRNA序列,将序列克隆至PGCsilencerTMH1/Neo质粒中,用脂质体将重组子转染至SMMC-7721细胞中,用RT-PCR方法检测iASPP表达的变化,Westernblot检测蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果:iASPP干扰质粒转染SMMC-7721细胞后,iASPP表达下降,凋亡细胞增加。结论:抑制内源性的iASPP,能有效地恢复肝癌细胞SMMC-7721中p53的抑癌功能。

实时荧光定量PCR技术检测iASPP基因在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的建立iASPP基因的实时荧光定量检测方法,并观察原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中iASPP mRNA的表达情况,分析临床病理学因素在肝癌iASPP基因和扩增中的作用。方法对46例病理学证实的HCC患者,利用荧光定量RT-PCR检测肝癌组织及癌旁组织iASPP mRNA表达,比较不同临床病理学类型肝癌中该基因表达差异。结果 46例肝癌组织中有33例的iASPP表达水平高于癌旁组织,占71.4%,表达差异有统计学意义[癌组织(16.00±10.31),癌旁组织(0.63±0.19),P<0.01);在不同肿瘤大小、病理分级中有统计学差异(P<0.05)],在患者的性别、年龄、癌栓形成、淋巴结转移分组中差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝癌组织中存在iASPP基因的高表达;iASPP基因表达与肿瘤大小、病理分级有关。

癌基因iASPP的克隆、表达与纯化

iASPP是新近发现的高度保守的p5 3相关基因,其蛋白产物定位于细胞核内,具有结合NF κBp65亚基和p5 3功能,进而抑制NF κB的转录调节和p5 3对凋亡的调节功能。利用RT PCR方法从人白血病细胞系U 937中克隆出癌基因iASPP ,将其克隆至原核表达载体pET2 8a( + )中,成功构建iASPP表达载体PIAF ,重组质粒读码框和序列与预期一致。在IPTG诱导下,重组载体大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,表达产物经SDS PAGE和Westernblot方法分析证实系iASPP融合蛋白。利用Ni离子鳌合层析的方法纯化iASPP融合蛋白,经SDS PAGE鉴定其纯度超过80 %。

iASPP蛋白抗体的制备及iASPP在结肠癌组织中的表达及意义

目的研究iASPP多克隆抗体在结肠癌组织中的表达与结肠癌的组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移的关系。方法根据生物信息学软件分析人iASPP蛋白的二级结构、亲水性、疏水性和抗原性等理化性质,经同源性检索,综合考虑抗体设计的其他因素,设计一段多肽,制备iASPP多克隆抗体。利用ELISA、Western印迹、免疫组织化学等方法来测定其效价和特异性。应用免疫组化(S-P)法检测30例结肠癌组织及15例正常结肠组织中的iASPP表达,判定其与结肠癌的组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移等临床病理学特征的关系。结果制备了抗人iASPP多克隆抗体;利用ELISA,Western印迹和免疫组织化学染色的方法证实此抗体效价较高,特异性较强。iASPP在癌组织不同分化者iASPP阳性率不同。在浸润深度及有无淋巴结转移中的表达差异无显著性。结肠癌组织中iASPP的阳性表达率较正常结肠组织高(P<0.05)。结论 iASPP的表达异常与结肠癌的进展有关,其表达的失调在结肠癌的预后中发挥着重要作用。

iASPP在p53缺失肿瘤细胞中影响细胞凋亡的机制

目的阐明iASPP在p53缺失细胞中影响细胞凋亡的机制。方法将iASPP、干扰iASPP、p63、p73、Bax-Luc和Puma-Luc等转染进H1299细胞中,观察各种情况下对前凋亡基因转录能力的影响;用体外转录/翻译偶联系统、免疫沉淀和Western blot方法研究iASPP与p63和p73在体外的相互作用;用细胞转染、免疫沉淀和Western blot方法研究iASPP与p63和p73在细胞内的相互作用。结果①H1299细胞转入iASPP后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力下降,分别只有对照组的0.14倍和0.13倍;②H1299细胞转入iASPP干扰质粒后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力增强,分别为对照组的3.58倍和4.14倍;③p63和p73转染H1299细胞后,前凋亡基因Bax和Puma启动子的转录能力增强,分别增加4.67倍和3.03倍(转染p63后)和5.90倍和3.36倍(转染p73后);④iASPP与p63、p73在体外和细胞内存在着相互作用;⑤干扰iASPP后p63和p73的蛋白表达水平不变。结论在p53缺失的H1299细胞中,iASPP是通过抑制p63/p73的转录因子的功能,从而影响前凋亡基因Bax、Puma等的转录活力,进而导致细胞凋亡变化的。

特异性siRNA抑制宫颈癌细胞中iASPP基因的表达研究

目的研究RNAi技术抑制宫颈癌细胞HeLa中iASPP基因的表达。方法构建真核细胞表达特异性shRNA的pGENESIL-1／iASPP重组质粒，脂质体转染HeLa细胞后用半定量RT-PCR和westernblotting技术分别检测RNAi前后HeLa细胞中iASPPmRNA和蛋白水平的变化；利用细胞计数和细胞克隆形成实验检测HeLa／PS-iASPP细胞的增殖能力，最后DNAladder实验测定细胞凋亡。结果成功构建了pGENEsIL．1／iASPP重组质粒；在RNAi24，48，72h后He—La细胞中iASPPmRNA分别下降了25．50％，85．60％和90．80％，iASPP蛋白水平显著下降；RNAi后细胞计数明显降低，细胞克隆形成抑制率为76．1％；RNA干扰后HeLa细胞DNA分子产生断裂并发生了凋亡的特征性改变。结论应用RNA干扰技术能有效地、特异地抑制宫颈癌细胞中iASPP基因的表达，iASPP基因可能成为治疗宫颈癌潜在的分子靶点。

抑制iASPP基因对大肠癌细胞凋亡作用的实验研究

目的通过构建针对p53凋亡抑制蛋白(inhibitory member of the apoptosistimulating protein of p53,i ASPP)的RNAi质粒,研究在体内外抑制i ASPP基因表达后对大肠癌细胞HT-29凋亡的影响。方法构建i ASPP的腺病毒RNAi质粒p Ad-i ASPP-RNAi,体外转染HT-29细胞,同时建立HT-29的裸鼠移植瘤模型;采用RT-PCR和Western blotting检测转染后瘤细胞i ASPP基因在mRNA和蛋白质水平的变化;采用流式细胞仪检测转染前后瘤细胞凋亡的变化。结果转染i ASPP RNAi后,与阴性对照组、空载病毒对照组相比,HT-29细胞的i ASPP mRNA及蛋白表达量均降低;i ASPP-RNAi组HT-29细胞的凋亡率、坏死率与阴性对照组及空白病毒对照组相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。裸鼠移植瘤细胞在病毒转染后,细胞体积增大,核染色质浓集,出现凋亡;移植瘤细胞的凋亡率、坏死率与阴性对照组、空载病毒对照组相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论在体内外抑制i ASPP基因的表达能够促进大肠癌细胞HT-29的凋亡,i ASPP有可能成为大肠癌分子免疫治疗的靶标。

iASPP——抑癌基因家族中的癌基因

ASPP1和ASPP2是新发现的能特异性地刺激P53细胞凋亡功能的分子,是抑癌基因家族新成员。最近又发现了这个家族的第三个成员iASPP,与前两个成员ASPP和ASPP2的抑癌功能不同,iASPP能抑制ASPP激活P53凋亡能力的作用,因此被称为是一种新的癌基因。在肿瘤细胞中已发现存在着高表达的iASPP,因此通过抑制iASPP来恢复肿瘤细胞中P53的抑癌功能有可能成为一种新的肿瘤治疗的手段。

iASPP蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其意义

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中iASPP蛋白表达规律及其与p53表达状态的相关性。方法:收集NSCLC术后同一患者的新鲜肺癌组织、癌旁组织、肺组织共54例用于试验研究。采用免疫组织化学方法检测肺癌组织、正常肺组织中认SPP蛋白表达及癌组织中p53表达以确定各病例的p53表达状态;Westem blot方法检测肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织中iASPP蛋白表达。结果:p53阴性状态:免疫组织化学检测结果显示癌组织中iASPP蛋白表达阳性率为71%,显著高于肺组织的21%(P=0.001)。Westem blot显示癌组织、癌旁组织、正常肺组织中表达量逐渐降低(P=0.020);相互间比较发现癌组织iASPP蛋白表达水平显著高于肺组织(P=0.007)、与免疫组织化学检测结果相一致。p53阳性状态下:免疫组织化学与Westem blot检测结果均显示iASPP蛋白在癌组织、癌旁组织、肺组织中表达无显著性差异。癌组织iASPP蛋白表达在p53阴性时显著高于p53阳性, p53阴性癌旁组织、肺组织iASPP表达与p53阳性比较无显著性差异(P>0.05)。结论: p53阴性状态下,NSCLC癌组织iASPP高表达,iASPP高表达可能与NSCLC的发生密切相关。

早孕小鼠子宫内膜组织中IASPP表达对胚胎着床的作用

目的:探讨早孕小鼠子宫内膜组织中P53凋亡刺激蛋白抑制因子(IASPP)的表达对胚胎着床的作用。方法:对NIH雌鼠进行阴道涂片以确定其动情周期,采用实时荧光定量PCR、Western blot以及免疫组化等分别在分子和蛋白水平上检测雌鼠子宫内膜上IASPP的表达情况;对实验组小鼠左侧子宫角注射IASPP抑制剂,最后测量IASPP在未孕小鼠及妊娠小鼠第2至7天子宫内膜的表达和胚胎着床数,进行统计分析。结果:IASPP的转录水平随时间推移而缓慢升高,并于雌鼠孕期内的第4天达到峰值(P<0.05),之后IASPP水平缓慢降低。Western blot实验结果也表明IASPP的蛋白水平随时间推移而缓慢增加,在雌鼠动情周期的第5天到达峰值(P<0.05),随后缓慢降低,与转录水平变化结果大致相近。免疫组织化学染色的结果显示,早孕小鼠子宫腔上皮、腺上皮的胞膜和胞浆,血管内皮以及基质细胞的细胞核表达IASPP蛋白均高于未孕组,且各个妊娠阶段表达存在差异;从怀孕开始,IASPP呈现表达逐渐增强的趋势,至孕第7天表达开始下降。从孕第8天开始,实验组左侧子宫胚胎着床数为(1.402±0.517),右侧为(6.420±1.075),对照组左侧子宫胚胎着床数的范围为(6.500±1.090),对照组右侧子宫胚胎着床数的范围为(6.200±0.919),数据显示实验组小鼠的左侧胚胎着床数明显低于右侧胚胎着床数(P<0.05),而对照组小鼠的左右侧子宫胚胎着床数目无明显差别(P>0.05)。结论:妊娠早期的小鼠子宫内膜组织中p53凋亡刺激蛋白抑制因子IASPP持续表达,并正向参与胚胎的着床调控过程。

iASPP蛋白与肿瘤相关性的研究进展

iASPP(inhibitor of ASPP family)是p53凋亡刺激蛋白家族ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)中唯一的一个抑制因子,能够抑制p53诱导的细胞凋亡。iASPP基因在癌组织中表达上调,对肿瘤的发生发展起重要促进作用,是肿瘤预后较差的一个重要标志。当iASPP基因沉默后,肿瘤细胞凋亡增多,因而iASPP基因有望成为肿瘤治疗的新靶点。

ASPP家族中癌基因iASPP的研究进展

p53是目前公认的肿瘤抑制基因,能诱导细胞周期阻滞或直接诱导细胞凋亡,但其如何作用这两种不同选择的机制尚不清楚,直到p53凋亡刺激蛋白（ASPP）家族的发现,才使这一问题逐渐明了。ASPP是Samuels等在2001年发现一种新的肿瘤抑制基因家族．随后在2003年又宣布发现了ASPP家族的另一个成员iASPP（inhibitory member of the ASPP family），ASPPI和ASPP2与p53结合后能激活p53的抑癌功能，

iASPP在大鼠脑缺血再灌注中的表达及其意义

目的观察p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of p53,ASPP)家族的抑制因子(inhibitorymember of the ASPP family,iASPP)在大鼠脑缺血再灌注后的表达及其意义。方法 48只清洁级、成年健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(8只)和脑缺血再灌注组(40只)。脑缺血再灌注组又分为缺血2h再灌注4h、12h、24h、48h和72h 5个时间点,其中每个时间点8只大鼠。苏木素—伊红染色测定脑梗死体积;原位末端转移酶标记技术检测半暗带细胞凋亡情况;免疫印迹法测定半暗带iASPP的表达变化。结果脑缺血再灌注4h组和24h组的凋亡细胞阳性率与假手术组存在统计学差异(P<0.01)。脑缺血再灌注组的脑梗死体积百分比与假手术组相比具有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比,在脑缺血再灌注12h时iASPP表达开始下降(P<0.01),再灌注24h降至最低(P<0.01),再灌注48h开始回升(P<0.01)。结论在脑缺血再灌注后,缺血半暗带凋亡细胞显著增多,iASPP表达下降,提示在脑缺血再灌注中iASPP的表达下降可能在细胞凋亡的发生中发挥重要作用,其表达上调可能具有神经保护作用。

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果:重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论:成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。