应用重组杆状病毒表达的IBDV VP2抗原建立其抗体监测方法

应用B ac-to-B ac杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株VP 2基因的重组杆状病毒reB acm id-VP 2蛋白,建立抗IBDV血清抗体的间接EL ISA检测方法,研究IBDV VP 2蛋白的结构与功能。结果表明:该方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示,其敏感性为93.4%,特异性为90.9%;对VP 2亚单位疫苗免疫的血清样本的8次重复检测,变异系数小于4%,表明该检测方法对VP 2亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(ChickenInterleukin2,ChIL2)融合基因的真核表达载体pCIVP2/4/3IL2、pCIIL2VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicingbyoverlappingextension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3IL2、IL2VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCIVP2/4/3IL2、pCIIL2VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RTPCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCIVP2/4/3IL2、pCIIL2VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL2作为分子免疫佐剂对IBDVDNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.

共表达鸡IBDV VP2和IL-2基因的重组毕赤酵母的构建及免疫原性

通过重叠延伸PCR扩增IL2-VP2串联基因,克隆到pMD18-T载体上,亚克隆正向插入到毕赤酵母表达质粒pPICZαA中,经PCR和双酶切鉴定表明成功构建了酵母重组表达载体pPICZαA-IL2-VP2。将该重组质粒线性化后电击转化入感受态毕赤酵母X-33菌株,构建成分泌型表达IL2-VP2的酵母工程菌株。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE、Western-blot活性检测分析表明IL2-VP2基因长度为1.85kb,包含缺失了TAA终止密码子的IL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP2基因,两个基因之间以高度柔韧性的(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸相连接,并在该体系中得到分泌表达,分子量约为50kD,且表达产物对传染性法囊病毒具有较好的反应原性。

CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用

以传染性法氏囊病病毒 (IBDV) VP2蛋白基因表达质粒 DNA为免疫原 ,以 Cp G的寡核苷酸 (Cp G- ODN)为免疫佐剂 ,肌肉注射于 14日龄 SPF鸡 ,1周后加强免疫 1次 ,2次免疫后 15 d和 2 1d分别测定血清 EL ISA抗体效价 ,并于免疫后 2 1d用 IBDV99J1强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示 ,(1) VP2基因重组质粒 DNA与 Cp G共同免疫组的 EL ISA抗体水平明显高于 VP2重组质粒免疫组 ;(2 ) IBD弱毒苗与 VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于 VP2重组质粒免疫组 ,且比 VP2基因重组质粒 DNA与 Cp G共同免疫组略高 ;(3) VP2基因重组质粒 DNA与 Cp G共同免疫组及 IBD弱毒苗与 VP2重组质粒免疫组可明显降低 IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明 ,Cp G寡核苷酸对 IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用 ,有很大的应用前景。

表达IBDV VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的免疫原性初步评价

本研究为了研发能同时预防传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染的二联苗,将IBDV VP2基因插入NDV LaSota疫苗株基因组的P基因和M基因之间,利用NDV反向遗传操作系统构建并成功获得重组病毒LS-IBDV-VP2。对重组病毒的鸡胚平均死亡时间(mean death time,MDT)、鸡胚半数感染量(egg infectious dose,EID50)和1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)等生物学特性进行测定,并对18日龄SPF鸡胚进行免疫接种,利用血凝抑制实验(hemagglutination inhibition test,HI)测定NDV抗体以及间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定IBDV VP2抗体,评价重组病毒的免疫应答反应。结果显示,重组病毒LS-IBDV-VP2的EID50为108.5/mL、MDT为147 h、ICPI为0;NDV抗体效价在孵化后第14天达到最高,与LaSota疫苗株差异不显著(P>0.05),并在孵化后第14天也能产生较高水平的IBDV VP2抗体。本研究结果表明,重组病毒LS-IBDV-VP2与LaSota疫苗株具有相似的生物学特性,但重组病毒毒力更低,并且能够有效诱导机体产生抗体,具有成为预防IBDV和NDV二联候选疫苗株的潜力。

不同时期8株IBDV地方株VP2基因变异分析

对分离于洛阳地区1991和2001年前后间隔达10年之久的两个时期的8株IBDV进行了VP2基因的克隆与序列分析。结果发现,8个地方株虽均属于IBDV超强毒株,但各个毒株间也有一定的差异。根据它们的核苷酸和氨基酸同源性高低可明显分为3群,分别位于系统进化树上超强毒区的3个小分支上。第1群包括1991年分离的L912、L914和L916三株;第2群包括L913、L017和L018三株;第3群包括2001年分离的L015和L016二株。群内各毒株间同源性较高,在98.3%～100%之间;群间各毒株的同源性则相对较低,在95%～97.9%之间,其中最低的为L015和L017、L016和L018二对,同源性均只有95%。进一步的序列分析表明,8个地方分离株均具有vvIBDV所具有的特征。其中,1991年的4株在各亲水区和七肽区的氨基酸和经典株及传统的超强毒株相比均无明显的变化;而2001年的4个分离株虽仍符合超强毒株的特点,但在相应亲水区均有1～2个氨基酸发生替换,特别是L015和L016株还出现了4个其它各毒株均没有的氨基酸位点变化。

表达IBDV VP2蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建及免疫原性分析

通过PCR克隆出IBDV VP2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-VP2。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-VP2)。进行重组菌VP2蛋白表达的鉴定;测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性以及小鼠免疫试验。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE和Western blot证实重组菌表达的VP2蛋白能与鸡抗IBDV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;口服重组菌免疫小鼠,ELISA检测产生了抗IBDV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。本试验成功构建了能稳定表达IBDV VP2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-VP2),为研究IBD口服基因工程疫苗奠定了基础。

IBDV地方野毒株(XX株)VP2基因高变区的克隆与序列分析

参考GenBank发表的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了1对特异扩增IBDVVP2基因高变区的引物。应用RT-PCR法,对分离于新乡地区典型发病鸡群的IBDV(XX株)进行了VP2基因高变区的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,XX株与超强毒株UK661,OKYM高度相似,核苷酸同源性分别为98.73%,99.15%,氨基酸同源性都为100%,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。

靶向传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2有效miRNA的筛选

为筛选出能有效抑制传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因复制的miRNA,采用RT-PCR方法从病毒基因组中进行结构蛋白VP2的基因扩增与序列测定,构建融合表达载体pVP2-EGFP。根据VP2测序结果,借助genscript软件设计针对VP2的5条miRNA,分别命名为miVP2A、miVP2B、miVP2C、miVP2D和miVP2E,将合成的5条miRNAs分别插入到pRFPRNAiC中形成miVP2s表达载体,这些载体分别与pVP2-EGFP共转染DF-1细胞系,通过NortheringBlotting方法检测miVP2s的表达,利用荧光共聚焦显微镜定性、流式细胞术定量的方法进行有效miVP2s的筛选。结果显示:miVP2s能成功表达;转染miVP2s表达载体组的绿色荧光蛋白(GFP)强度和数量都明显弱于或少于阴性对照组;miVP2s对VP2的抑制效率为59.7%到78.5%。表明所设计的miRNAs对VP2均有抑制作用,其中miVP2A和miVP2E效果最为显著。

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用 RT-PCR 法对 vp2 基因高变区进行了扩增,构建重组质粒 pMD18T- vp2,测序。与有代表性的 IBDV 毒株 VP2 基因高变区序列进行比较分析,以 ClustalX 软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDVY3、P2G、P8G、SZ、Y5 和 W04(6 株)IBDV 与 D6984(荷兰)的同源性达到 99.0%以上,与其它一些超强毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)的同源性也达到了 97.8%以上,并在关键氨基酸位点符合 vvIBDV 特征,采用Phylip3.5 软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为 vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为 IBDV 分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据。

IBDV地方变异株VP2基因的克隆与特性鉴定

应用 RT- PCR技术对 1株分离于地方免疫鸡群中暴发的传染性法氏囊病病例的传染性法氏囊病病毒 ( infec-tious bursal disease virus,IBDV) HN0 2 6株的 VP2基因进行了克隆与序列分析 ,并与相应毒株的 VP2高变区核苷酸及氨基酸序列进行了比较研究。结果表明 ,HN0 2 6株的核苷酸和氨基酸序列与变异株 Var- A的同源性最高 ,分别达97.3%和 97.6 % ;其次为超强毒株 UK6 6 1 ,分别为 95 .7%和 95 .2 % ;而和弱毒株 PBG98的同源率仅有 92 .8%和90 .3%。其中 ,在第一、二亲水区 ,HN0 2 6株均有 1个氨基酸发生了变化 ,即第 2 2 2位转变为 E、第 31 8位转变为 D。更重要的是 ,其 2 4 9位和 2 5 4位上的氨基酸分别为 K和 S,这些均为变异株的特性。另外 ,HN0 2 6株的七肽区保持SWSASGS不变 ,且第 2 79位和 2 84位氨基酸分别为 D和 A,又完全具备强毒株的特性。因此 ,初步确定所分离的HN0 2 6为有较强致病力的变异株 IBDV。

Bac-to-Bac系统双表达蛋白IBDV VP2-IL-18免疫原性的研究

把用Bac-to-Bac系统单表达或双表达的蛋白IL-18、传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2和IBDV VP2-IL-18与IBD疫苗同时腿部肌肉多点注射免疫14日龄SPF鸡,14d后加强免疫1次;免疫前、后均采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量和ELISA抗体效价。二免后第21天用vvIBDV-GX8/99毒株进行攻毒。结果显示,VP2-IL-18、VP2+IL-18、IL-18+IBD疫苗、VP2分别免疫雏鸡后均能促进CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖和抗体水平的增加,能明显增强攻毒保护率,但VP2-IL-18免疫组要优于VP2+IL-18混合免疫组及其他免疫组和对照组,差异显著(P<0.05)。上述结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18不仅能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,而且还可以产生较高保护率,为新型IBD疫苗的研制奠定了基础。

IBDV-VP2基因高变区同义密码子在蛋鸡和乌鸡中的偏嗜性

以RT-PCR方法对河南省洛阳地区2000～2002年分别从IBD发病蛋鸡和乌鸡鸡群中分离到的5株和4株IBDV进行了VP2高变区基因的扩增、克隆和测序.核苷酸和氨基酸序列分析发现,9株IBDV中有4处氨基酸发生了变化,即320位的Gln/His,349位的Val/Ile,375位的Pro/Ser和381位的Lys/Arg.这些氨基酸的变化,不符合变异株的特征.核苷酸序列变化主要表现在同义密码子的置换.分别将分离于蛋鸡和乌鸡的各3个毒株交叉感染乌鸡和蛋鸡鸡胚,盲传7代后取尿囊腔绒毛膜分离病毒进行VP2基因的序列分析.结果表明,IBDV VP2基因高变区某些氨基酸同义密码子在蛋鸡和乌鸡细胞中的选择上有偏嗜性.主要表现在第1亲水区220位的Tyr(TAC/TAT);224、360、393位的Gly(GGA/GGG);260及420位的Thr(ACC/ACT,ACA/ACT);271位的Val(CTA/CTC);279位的Asp(GAC/CAT);305位的Ile(ATC/ATA)及328位的Ser(TCA/TCG).病毒在不同品种宿主中对同义密码子使用的偏嗜性,可能是导致蛋鸡和乌鸡时IBDV易感性不同的一个重要原因,也可能是病毒变异及新毒株产生的一条重要途径.

以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。

IBDV超强毒株和弱毒株VP2基因同义密码子使用偏爱性研究

应用RT-PCR方法扩增并克隆了分离自河南省的30株IBDV超强毒和9株弱毒株VP2基因cDNA序列,研究IBDV超强毒和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况。结果表明,超强毒株和弱毒株除特定位点的特征性氨基酸不同外,在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有关,进而可能影响到IBDV的毒力。

IBDV不同野毒株鸡胚传代过程中VP2基因变异动态的研究

对分离于河南省的YX08、YX12和YB02 3个IBDV野毒株进行了鸡胚连续传代,对各变异代数的VP2高变区基因进行了RT-PCR扩增和序列分析。结果显示,各毒株随传代次数的增加,与经典毒株Cu-1及弱毒株P2的同源性有所增高;各毒株的变异代数和变异位点不尽相同,232位、233位、234位及253位氨基酸的密码子在传代过程中是易变密码子。

传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价

【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株(vaIBDV)VP2蛋白原核表达质粒,并明确VP2蛋白的免疫原性,为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。【方法】从IBDV新型变异株(BZ)中扩增VP2基因片段,亚克隆至pET-28a(+)载体上构建重组原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡,通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。【结果】在25℃下以IPTG进行诱导表达,获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表达,大小约40 kD,且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应,其琼扩效价可达1∶32;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好,安全性高,无免疫引起的不良反应,剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8,而血清抗体效价均在1∶20000以上,表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应,抗体阳性率达100%;使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况,结果显示免疫组鸡只均未发病,其法氏囊也无明显萎缩现象,即免疫保护率达100%。【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达,且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好,能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果,为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。

IBDV不同分离株VP2高变区的基因序列分析

对9个IBDV(传染性法氏囊病毒)分离株的VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序,得到约560bp长的片段。分析比较9个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI～SpeI)的氨基酸序列,并构建进化树。结果表明,9个IBDV分离株是超强毒株,并且得出亚洲目前流行的vvIBDVs与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。

传染性法氏囊病病毒YL051、YL052的分离及其VP2基因高变区序列的比较分析

应用鸡胚绒毛尿囊膜接种的方法，从一个疑患传染性法氏囊病的鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）（分别命名为YL051和YL052）；利用反转录-聚合酶链式反应技术扩增分离株VP2基因的高变区序列，并采用限制性内切酶分析技术和核苷酸序列测定技术，对分离株进行致病型鉴定及其基因差异的分析。结果表明：分离株YL051属IBDV的超强毒株（vvIBDV），而YL052株既具有强毒株的特征即七肽区（SWSASGS）和279D，但同时也具有284T的弱毒株特征，可能属于介于强毒株与弱毒株之间的一个中间型。与国内外参考毒株的序列比较分析发现：YL051与其他vvIBDV的核苷酸同源性达94％～97％；YL052则与经典毒株STC、疫苗株B87的核苷酸同源性均为94．3％。

传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定

为鉴定IBDV VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份。应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性。结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1∶105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合。本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础。