2019-2023年山东省鸡主要疫病流行动态分析及其防控对策

本文通过临床症状、病理剖检,结合分子病原学检测技术等对2019-2023年送检的鸡疑似病例进行实验室综合诊断发现:近五年来,家禽呼吸道疾病居高不下,种源性疫病不断攀升,免疫抑制性疾病潜在危害突出。其中呼吸道疾病病原仍以传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)的危害最为严重;种源性疾病病原位居前三位的是鸡传染性贫血病毒(CIAV)、腺病毒I群(Fad V-I)和滑液囊支原体(MS);免疫抑制病病原以传染性法氏囊炎病毒(IBDV)最为突出;肿瘤疾病病原中马立克病病毒(MDV)占居首位。选取上述鸡主要病原IBV、AIV-H9、CIAV、IBDV、MDV的关键基因进行测序,分析其遗传演化动态,以期对未来家禽的健康生产提供服务和指导。

肉鸡源传染性法氏囊病新型重排毒株的分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确云南某肉鸡场疑似传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染病例的病原类型及分子特征,以了解IBDV新型重排毒株在肉鸡中的流行情况、分子进化趋势,为制定有效的传染性法氏囊病(IBD)防控和疫苗选用策略提供参考依据。[方法]对疑似IBDV感染的病鸡法氏囊进行研磨处理后,采用巢式RT-PCR进行检测,后将IBDV阳性的法氏囊组织悬液接种于9日龄SPF鸡胚并进行病毒分离,对病毒的vVP2和VP1-b基因扩增并进行遗传变异分析。[结果]成功分离出一株新型IBDV重排毒株(命名为YN-YX221110),接种9日龄SPF鸡胚后,胚体整体呈现弥漫性出血,头、颈以及背部皮肤有出血点。基于vVP2基因序列,分离株YN-YX221110与新型变异株(nvIBDV)参考株的核苷酸相似性最高,为93.2%~97.9%,分离株YN-YX221110的vVP2基因222A特征性氨基酸位点与UK661、HK46等超强毒株(vvIBDV)参考株相同,249K、256V、279N、284A、294L、299S等位点与新型变异株(nvIBDV)参考株中的SHG19相同;在基于vVP2基因的遗传进化树中,分离株YN-YX221110与GX-QZ191002、SHG19等nvIBDV参考株聚为一支,属于A2d分支。基于VP1-b基因序列,分离株YN-YX221110与参考株中的经典毒株(cIBDV)类似株核苷酸相似性最高,为97.8%~98.4%,分离株YN-YX221110的vVP2基因特征性氨基酸位点240D、242D、287T、390L和393E与致弱毒株(attIBDV)参考株中的B87、Gt相同;在基于VP1-b基因序列的系统发育进化树中,分离株YN-YX221110与参考株Gt、B87和CEF94等cIBDV类似株中的attIBDV聚为一支,属于B1a分支。分离株YN-YX221110基因型为A2dB1a。[结论]成功分离得到肉鸡源IBDV分离株YN-YX221110,其A片段来源于nvIBDV,B片段来源于cIBDV类似株中的attIBDV,为新型IBDV重排毒株。

鸡传染性法氏囊病的诊断与防治

传染性法氏囊病(IBDV)的病原是传染性法氏囊病病毒,此病具有发病急、极易发生接触性传染的特点。患病鸡大多为雏鸡,会突然发病,短时间内大量死亡,病情发展迅速且不好控制,很难治愈。此病的临床表现为法氏囊肿胀、表面黏膜有出血点,腿部和胸部有条状出血,肾脏肿胀并伴有斑点沉积。本文总结了鸡传染性法氏囊病的症状及防治方法。

2022年监测中心第四季度禽病检测动态

1鸡病原检测结果2022年10~12月共收到鸡疑似病例样品733份。检测结果显示,检测到的病原以免疫抑制性病原、呼吸道疾病病原和肝损伤性病原为主。在免疫抑制性病原中,以鸡传染性贫血病毒(CAV)居多,CAV疑似病例的阳性检出率是47.5%;其次是鸡传染性法氏囊病毒(IBDV),IBDV疑似病例的阳性检出率是17.5%;鸡呼肠孤病毒(C-REOV)和网状内皮增殖症病毒(REV)两种病原的检出比例相当,其疑似病例的阳性检出率均是2.5%。

传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价

【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株(vaIBDV)VP2蛋白原核表达质粒,并明确VP2蛋白的免疫原性,为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。【方法】从IBDV新型变异株(BZ)中扩增VP2基因片段,亚克隆至pET-28a(+)载体上构建重组原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡,通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。【结果】在25℃下以IPTG进行诱导表达,获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表达,大小约40 kD,且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应,其琼扩效价可达1∶32;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好,安全性高,无免疫引起的不良反应,剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8,而血清抗体效价均在1∶20000以上,表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应,抗体阳性率达100%;使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况,结果显示免疫组鸡只均未发病,其法氏囊也无明显萎缩现象,即免疫保护率达100%。【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达,且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好,能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果,为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。

传染性法氏囊病病毒新型重排毒株GX-NN200111的分离鉴定及遗传进化分析

为明确广西某养殖场疑似传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染鸡的病原类型及分子特征,试验通过病毒分离、基因扩增、序列测定、核苷酸同源性分析、系统进化树构建、氨基酸位点变异分析、重组及选择压力分析等方法进行病原研究。结果显示:成功分离一株IBDV新型重排毒株(命名为GX-NN200111),该毒株属最新发现A3B1b基因型;分离株GX-NN200111能够在鸡胚中很好地增殖,表现为鸡胚头、颈、背部皮肤出血;序列分析显示,分离株GX-NN200111 vVP2属于超强毒株分支A3,核苷酸相似性为93.7%~97.9%,具有超强毒株特征性氨基酸位点212N、222A、256I和294I;VP1-b属于中国新型变异株分支B1b,核苷酸相似性为95.8%~99.7%,具有中国新型变异株的特征性氨基酸位点240E;重组分析未见有证据证实分离株GX-NN200111存在明显的重组事件,选择压力分析发现分离株GX-NN200111在vVP2和VP1-b中分别存在3个(第205、222、249位)和2个(第331、426位)正选择位点;氨基酸置换熵值分析发现分离株GX-NN200111在vVP2和VP1-b中分别存在10个(第213、222、242、249、253、254、256、279、294、299位)和4个(第242、287、390、393位)易突变位点。研究证实,分离株GX-NN200111是首次发现的一种新的重排毒株(A3B1b),其A节段来源于超强毒株、B节段来源于中国新型变异株。

鸡乳酸脱氢酶A基因突变对DF-1细胞能量代谢和法氏囊病毒增殖的影响

通过启动子优化构建了适用于DF-1细胞的CRISPR载体;随后通过同时共转靶向GgLDHA的2条sgRNAs,获得了13株GgLDHA基因突变型细胞株,其蛋白表达水平和酶活出现不同程度的下降。通过对突变克隆细胞株生长、葡萄糖和乳酸代谢、能量代谢以及IBDV增殖研究发现,乳酸对葡萄糖得率从2.1显著下降为1.6,腺苷三磷酸(ATP)合成速率明显提高,相比对照细胞最高提高了57%,突变细胞株的能量代谢效率获得了有效改善。突变型细胞株的IBDV滴度较野生型均有明显增加,相比对照最大提高了5倍。通过定向突变GgLDHA基因,明显降低了DF-1细胞的乳酸积累,有效改善了细胞的能量代谢,并显著促进了IBDV病毒的增殖,为提高IBDV病毒疫苗的生产能力提供了一种新思路。

鸡传染性法氏囊病的诊断与治疗

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起禽类的一种高度接触性传染病,可引起法氏囊病变、萎缩,导致机体免疫力下降,感染其它疾病的风险增加,为禽类养殖带来了一定的困扰和经济损失。1流行病学鸡和火鸡是传染性法氏囊病毒的天然宿主,IBDV几乎可以感染所有类型的鸡群,一般以2~6周龄的幼鸡为主要感染对象。该病没有明显的季节性,全年任何时段均可发生,但每年6~9月份为发病高峰期[1]。

VP1甲基化修饰对传染性法氏囊病病毒的复制至关重要

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)属于禽双RNA病毒科双RNA病毒属,IBDV主要感染雏鸡,3日龄至8周龄鸡均可感染,以5周龄鸡最为易感。1997年我国首次在广州发现并分离到病毒,IBDV现已全球流行。有关其病毒学特征、致病性等方面的研究尚不全面,依然存在很多未知。VP1是该病毒的唯一RNA依赖的RNA聚合酶,负责病毒基因组复制与转录,也是抗病毒药物研发最佳设计靶点。病毒蛋白翻译后修饰在调节病毒复制中发挥重要作用,修饰位点是非常重要的抗病毒药物研发靶点,有关IBDV VP1翻译后修饰研究较少,2009年报道VP1可以发生盐酸胍修饰。

VP1磷酸化修饰对传染性法氏囊病病毒复制至关重要

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)为双RNA病毒属、禽双RNA病毒科成员,IBDV主要感染5周龄左右的雏鸡,常伴随细菌继发感染,迅速增加死亡率。自上世纪50年代发现并分离到IBDV以来,对其研究持续了近70年。有关其病毒学特征、致病性等方面的研究尚不全面,依然存在很多未知。VP1是该病毒RNA依赖的RNA聚合酶,负责病毒基因组复制与转录。病毒蛋白翻译后修饰在调节病毒复制中发挥重要作用,有关IBDV VP1翻译后修饰研究较少,2009年报道VP1可以发生盐酸胍修饰,但对其聚合酶活性无影响。2019年研究报道VP1泛素化、SUMO1化修饰,均有助于VP1聚合酶活性和IBDV复制。有关VP1磷酸化修饰未见文献报道,因此研究IBDV VP1磷酸化修饰的分子机制及其生物学意义,为深入解析VP1功能提供理论依据,同时为寻找IBDV致弱位点提供线索。

传染性法氏囊病病毒和禽致病性大肠杆菌的二重探针实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立用于传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽致病性大肠杆菌混合感染快速鉴别检测的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,研究分别根据IBDV VP2基因和大肠杆菌UidA基因设计合成特异性引物和探针,通过普通PCR方法扩增目的基因片段并克隆至pGM-T载体,构建重组质粒pGM-T/VP2和pGM-T/UidA作为标准品,通过正交试验确定引物和探针的最佳浓度,分别建立基于VP2和UidA基因的标准扩增曲线,并进一步验证其特异性、灵敏性、重复性,建立的方法应用于人工感染样本和临床样本的检测,并与常规PCR方法进行比较。结果显示:VP2和UidA基因的最佳上、下游引物浓度均为0.30μmol/L,VP2和UidA基因的探针浓度分别为0.35μmol/L和0.25μmol/L;VP2和UidA基因扩增的线性范围均为10^(3)~10^(7)拷贝/μL,相关系数R2≥0.99,灵敏度均为100拷贝/μL;两者组间及组内变异系数均小于2%;人工感染样品与临床样品的检测结果与普通PCR方法一致。研究表明,建立的二重探针FQ-PCR方法为同时检测IBDV和禽致病性大肠杆菌提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。

鸡传染性法氏囊病对鸡法氏囊和腺胃组织结构的影响及防控措施

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)主要引起雏鸡的一种接触性、急性传染病,严重损害鸡法氏囊和腺胃组织结构,其中作为中枢免疫器官的法氏囊受损后,影响B淋巴细胞的产生,进而影响鸡的免疫力,使鸡感染疫病,并造成鸡群感染其它疫病的机率增加,使鸡群死亡率升高,给养殖户带来较大的经济损失。本文从鸡传染性法氏囊病的流行特点、IBDV对法氏囊和腺胃等组织结构的病理变化进行阐述,并针对该病提出具体的防控措施,以期在养殖过程中为养殖户防控鸡传染性法氏囊病提供帮助。

雏鸡在感染IBDV后红细胞免疫功能变化的研究

在经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡研究了感染ＩＢＤＶ后红细胞免疫功能的变化。结果表明：从以ＩＢＤＶ攻毒前１天到攻毒后头５天内，未免疫攻毒鸡（Ａ组）和免疫攻毒鸡（Ｂ组）ＲＢＣ－ＣＲ１花环率降低或显著降低，而未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）没有类似变化，高于Ｂ组，明显高于Ａ组，以后Ａ和Ｂ组逐渐回升到攻毒前水平。Ａ和Ｂ组ＲＢＣ－ＩＣ花环率在ＩＢＤＶ攻毒后第５天明显降低，均显著低于Ｃ组水平，以后Ａ组仍处于较低水平上变动，Ｂ组即逐渐回升，三组比较，Ａ组仍低于Ｃ组，同时也低于Ｂ组。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的

传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。

雏鸡混合感染IBDV与CAV的研究

实验分为 4组 :空白对照组、CAV感染组、IBDV感染组、IBDV_CAV混合感染组。选择IBDV发病严重期 (6日龄 )与CAV发病严重期 (13日龄 )测定并计算各组鸡的法氏囊、胸腺和体重的比值 ;分离外周血、法氏囊和胸腺中的淋巴细胞 ,加入适量的刀豆蛋白 (ConA)和商陆凝集素 (PAM)作为有丝分裂刺激原 ,利用MTT法检测实验鸡免疫细胞的功能变化 ;统计死亡率 ,绘制死亡曲线。研究发现 ,IBDV与CAV的混合感染较单独感染严重降低了感染鸡免疫活性细胞的增殖功能 ,并同时增强了IBDV或CAV的致病力 ,出现两次死亡高峰 ,病死率达 10 0 %。

浙江地区传染性法氏囊病毒变异株分离及鉴定

７ 株鸡传染性法氏囊病的法氏囊组织直接在鸡胚成纤维细胞盲传２ ～１５ 代后，均能不同程度产生细胞病变效应（ ＣＰＥ） ，并通过病毒血清中和试验、动物回归试验、电镜观察、琼脂免疫扩散试验，理化特性测定等试验证实七株病原为传染性法氏囊病病毒。在此基础上将７ 个浙江地区的ＩＢＤＶ 野毒株、１ 个四川地区的ＩＢＤＶ 野毒株和２ 个疫苗毒株经病毒—血清交叉中和试验获得了抗原性不同的五个亚型毒株或变异株。根据交叉中和试验所得的Ｒ 值，应用聚类分析法分析了各亚型毒株之间的亲缘关系，显示传染性法氏囊病病毒的变异存在地或性差异。

传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定

为鉴定IBDV VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份。应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性。结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1∶105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合。本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础。

肉鸡神经内分泌免疫网络抗传染性法氏囊病病毒感染的机制

以Ａｖｉａｎ鸡为实验对象，研究了神经内分泌免疫网络在传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）弱毒免疫和强毒感染时发生的调节机制。结果表明，ＩＢＤＶ弱毒免疫能获得高滴度的血清ＩＢ－ＤＶ抗体。未免疫肉鸡感染ＩＢＤＶ强毒后会引起免疫功能抑制。ＩＢＤＶ攻毒后，肉鸡血浆皮质酮、ｃＧＭＰ升高，Ｔ淋巴细胞转化率、白介素－２活性明显降低。ＩＢＤＶ弱毒免疫肉鸡遭受ＩＢＤＶ强毒感染后，血浆ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ同时升高并呈现高阈平衡。ＩＢＤＶ攻毒前后，肉鸡血浆ＡＣＴＨ、皮质酮和免疫功能指标间有显著的相关性，提示外来病原入侵后，肉鸡垂体－肾上腺轴可调节免疫功能。

硫酸化黄芪多糖对CEF生长及抵抗IBDV感染的影响

采取一步醇沉和分步醇沉法提取4种黄芪多糖APSt、APS40、APS50和APS60,用氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰,得到4种硫酸化黄芪多糖(sAPS)sAPSt、sAPS40、sAPS50和sAPS60,用MTT法比较了4种硫酸化黄芪多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的生长及抵抗鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染的影响,以未修饰的APSt为对照。结果显示,APSt显著促进CEF生长,细胞毒性较低,但抵抗鸡传染性法氏囊病毒感染细胞的作用较弱;sAPS抵抗鸡传染性法氏囊病毒感染的作用显著增强,显效浓度降低,但安全浓度也降低。表明通过硫酸化修饰可以提高黄芪多糖的抗病毒活性,但高浓度sAPS的细胞毒性增强。