猪轮状病毒G9P[7]型云南株的分离鉴定及VP4和VP7基因测序分析

为确定云南省某猪场仔猪腹泻的病原,对送检腹泻病仔猪小肠组织样品进行猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)RT-PCR检测,将PoRV检测阳性样品处理后接种至MA-104细胞进行PoRV分离;对分离毒株进行间接免疫荧光、电镜观察、胶体金检测和VP4、VP6、VP7基因测序及遗传进化分析。结果显示,仔猪肠道组织样品经终浓度20μg/mL的胰酶在37℃孵育2 h,能在MA-104细胞上增殖传代,第3代出现稳定的细胞病变,盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测;间接免疫荧光试验可见特异性荧光,胶体金和RT-PCR检测均为PoRV阳性,电镜观察可见病毒粒子直径约为65 nm,呈车轮状,符合PoRV粒子典型形态特征,将该分离株命名为PoRV YN-A株。基因同源性比较和遗传进化树分析显示,YN-A株的VP6基因序列与国内A群GD株的同源性为99.93%,VP7与中国G9型NJ2012株的同源性为99.12%,VP4与美国P[7]型OSU株的同源性为98.91%,确定该分离株为猪A群轮状病毒G9P[7]型。YN-A株VP7序列在9个氨基酸位点存在点突变,即aa9(I→V)、aa16(V/T→I)、aa44(A→V)、aa100(D/E→N)、aa212(T/A→K)、aa221(N→S)、aa225(V→A)、aa271(I→V)、aa267(D→E)。首次从云南地区的腹泻仔猪小肠组织中成功分离到1株G9P[7]型的新基因型PoRV毒株,为PoRV的致病性、分子生物学特性研究及PoRV G9优势基因型新疫苗研发奠定了基础。

负载乳源抗菌肽BCp12的复合乳液制备工艺研究

本研究利用乳清分离蛋白(WPI)和羧甲基壳聚糖(CMCS)为载体,负载乳源抗菌肽BCp12;以复合乳液的抑菌率为指标,优化最佳制备工艺,利用扫描电镜(SEM)和分子对接技术进一步揭示复合乳液潜在的交联机制。结果表明,复合乳液的最佳制备工艺为:WPI∶CMCS=1∶1.5、抗菌肽BCp12浓度为1 mg/mL;复合乳液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为74.56±0.61%和70.58±0.44%,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌直径分别为20.50±1.08 mm和19.33±0.85 mm。SEM显示复合乳液质地细腻且均一,三种物质具有良好的相容性。分子对接发现BCp12-WPI-CMCS的复合乳液主要通过C=O、-NH2及-OH形成氢键相互结合,其中BCp12中的Y1位氨基酸是最佳结合位点。本研究为BCp12-WPI-CMCS复合乳液的开发和保鲜应用提供一定的技术参考。

黄芪多糖分离与结构特征分析

目的从黄芪中提取分离多糖并对其进行理化性质及结构特征分析。方法采用DEAE-52和Sephadex G-100色谱柱分离纯化,得到黄芪均一多糖APS-Ⅰ和APS-Ⅱ,通过高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)和环境扫描电镜(ESEM)对APS-Ⅰ和APS-Ⅱ进行结构及形貌特征分析。结果 APS-Ⅰ和APS-Ⅱ为均一多糖,APS-Ⅰ中单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖,且摩尔比率为29.12∶1.89∶4.00∶1.35∶1∶81.97;APS-Ⅱ中单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖,且摩尔比率为50.46∶1.16∶1∶2.27∶2.66∶15.72∶7.86。IR显示APS-Ⅰ和APS-Ⅱ均为酸性多糖。ESEM观察显示APS-Ⅰ形貌工整,APS-Ⅱ形貌不规则。结论 APS-Ⅰ是一种呈丝带状结构分子量约为1.06×104Da的杂多糖,APS-Ⅱ是一种分子量约为2.47×106Da的杂多糖。

球孢白僵菌HsbA蛋白的原核表达及免疫定位

【目的】明确虫生真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)疏水表面结合蛋白HsbA(hydrophobic surface binding protein A)的致病过程。【方法】对HsbA进行克隆、亚克隆和原核表达,根据纯化后的蛋白制备多克隆抗体并进行抗原性分析,利用免疫电镜对HsbA蛋白进行定位观察。【结果】原核表达系统成功诱导了白僵菌的HsbA融合蛋白,制备多克隆抗体经Western杂交分析表明,该多抗能特异性识别目的蛋白。免疫电镜结果显示,HsbA蛋白在孢子和菌丝中呈随机分布。正常生长状态下,菌丝中的HsbA蛋白数量要明显多于孢子中被标记的数目,此外,孢子在侵染状态和正常生长状态下的HsbA蛋白数量也有显著差异,侵染状态下孢子的HsbA蛋白表达量更高,但菌丝在这2种状态下均呈现高表达。感染虫体中HsbA蛋白被标记的部位集中在体壁。【结论】原核表达实现了HsbA蛋白的高效表达,且制备的多克隆抗体具有较好的免疫原性。此外,免疫定位表明HsbA蛋白与菌丝的生长有关,并在白僵菌致病过程中参与了吸附作用,其作用部位位于昆虫体壁。

葡萄幼苗对温度逆境交叉适应过程中HSP70在叶片中的亚细胞定位

为了进一步分析热激蛋白在温度锻炼诱导的交叉适应性形成过程中的保护功能,此文以葡萄(Vitis vinifera L.cv.Jingxiu)幼苗为试材,采用胶体金免疫电镜定位技术,定位观察了HSP70在葡萄叶片中的亚细胞分布情况。结果表明,低温锻炼预处理可增强其在高温胁迫条件下的表达水平,细胞核和叶绿体中代表HSP70的免疫金颗粒密度比相应的对照细胞明显增多,尤其是胁迫处理3 h时。与低温锻炼相似,高温锻炼预处理增强了葡萄叶片在高温胁迫下细胞核和叶绿体中HSP70的表达量。这一结果为HSP70参与温度锻炼诱导的交叉适应性提供了更直观的细胞学证据。

葡聚六糖诱导后对黄瓜细胞内钙信使的影响

为明确葡聚六糖诱导黄瓜后对钙信使的影响,以黄瓜叶片为试材,测定葡聚六糖诱导后黄瓜细胞内Ca2+含量及Ca2+-ATPase活性变化,同时用免疫胶体金电镜技术观察了对钙调素(Calmodulim,CaM)分布的影响。结果表明,葡聚六糖诱导后黄瓜可溶性钙含量在12 h即达到高峰值,全钙含量在24 h达到高峰值,144 h不溶性钙达到峰值,Ca2+-ATPase活性在48 h达到最高峰。电镜下观察到在黄瓜的细胞核、叶绿体、液泡、细胞间隙、线粒体、细胞壁都有CaM分布,以叶绿体和细胞壁较多,清水对照在叶绿体和细胞壁有较少分布。葡聚六糖激活钙信使系统,可能参与光合作用,从而提高植物抗病性。

蚕豆保卫细胞中钙调素的免疫电镜定位

以蚕豆横切和平切气孔为材料 ,对钙调素进行了免疫胶体金电镜定位的结果表明 :在蚕豆保卫细胞的细胞核、细胞质、细胞膜、叶绿体、液泡、高尔基体、细胞壁中都有金颗粒分布 。

电针对APP/PS1转基因小鼠海马及血脑屏障Aβ水平的影响

目的:通过观察电针对APP/PS1转基因小鼠海马、血脑屏障Aβ及行为学的影响,探讨电针能否通过改善血脑屏障Aβ清除能力来治疗阿尔茨海默病。方法:将24只6月龄雄性APP/PS1转基因小鼠随机均分为电针治疗组与模型组,正常对照组选取12只同性别的C57BL/6野生背景鼠。电针治疗组电针"百会""涌泉"穴,治疗后采用Morris水迷宫进行行为学检测,观察各组小鼠学习记忆能力;用ELISA测定Aβ1-42在海马的表达水平;使用胶体金免疫电镜观察Aβ1-42在海马脑微血管壁的表达。结果:Morris水迷宫试验显示模型组与正常组比较,逃避潜伏时上升,穿越平台位置次数及平台象限游泳时间、路程所占总时间和总路程百分比下降(P<0.01或P<0.05),电针治疗组逃避潜伏时较模型组下降(P<0.01);ELISA检测海马Aβ1-42结果显示电针治疗组较模型组明显降低(P<0.01);免疫电镜结果显示电针治疗组脑微血管壁胶体金颗粒较模型组减少。结论:电针治疗可改善APP/PS1转基因小鼠空间认知能力,降低海马Aβ1-42水平,其机制可能与改善血脑屏障Aβ清除能力有关。

场发射电子显微镜实验室设计

场发射电子显微镜是新型超高精密的设备 ,其对机房安装环境有特殊要求。为保证这种电子显微镜获得高分辨率图像 ,必须严格控制震动和环境磁场的干扰。本文对场发射电子显微镜实验室的防磁、防震和接地等问题进行分析 ,通过实际施工后的现场检测证实本设计满足了场发射电镜室对环境的技术要求 ,保证了我校两台场发射电镜顺利安装验收。

非何杰金恶性淋巴瘤病人血清及瘤组织中β-葡萄糖醛酸酶同步测定及意义

目的 :探索非何杰金恶性淋巴瘤病人体内 β-葡萄糖醛酸酶 (β- glucuronidase,β- G)的变化规律。方法 :采用酶联免疫吸附测定 (enzym e- linked imm unsorbent assay,EL ISA)方法 ,免疫组织化学方法对 13例非何杰金恶性淋巴瘤患者血清及瘤组织中 β- G进行同步测定 ,并对其中 3例进行了免疫电镜研究。结果 :β- G在非何杰金恶性淋巴瘤患者血清及瘤组织中均呈明显表达 ,与对照组有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 :对 β- G进行机能学与形态学的联合检测 。

低温锻炼诱导葡萄幼苗的耐热性过程中sHSP17．6在叶片中的亚细胞定位

为了探讨热激蛋白在低温锻炼诱导的耐热性形成过程中的保护功能,进一步分析葡萄幼苗对温度逆境产生交叉适应性的细胞学机制,试验以葡萄(Vitis vinifera L. cv. Jingxiu)幼苗为试材,采用胶体金免疫电镜定位技术,定位观察了小分子热激蛋白17.6(sHSP17.6)在葡萄叶片中的亚细胞分布情况,结果表明,低温锻炼预处理可增强其在高温胁迫条件下的表达水平,细胞核和叶绿体中代表sHSP17.6的免疫金颗粒密度比相应的对照细胞明显增多,尤其是胁迫处理3 h时。这一结果为sHSP17.6参与低温锻炼诱导的耐热性提供了更直观的细胞学证据。

烟草叶片细胞分离方法与扫描电镜观察

比较研究了烟草叶片细胞分离条件及分离细胞制备扫描电镜观测样品的方法．成功地获得了烟草叶片的分离细胞．通过对不同部位叶片分离细胞进行电镜观察。

钙诱导花生蛋白纳米颗粒的制备及其工艺优化

花生蛋白作为大宗优质的植物蛋白质,资源丰富,营养价值高,具有良好的开发潜能。以花生分离蛋白为基质材料制备花生分离蛋白纳米颗粒,并优化其最佳制备工艺。通过纳米激光粒度仪及透射电子显微镜(TEM)对纳米颗粒的粒径及形态进行表征。结果表明,制备的纳米颗粒球形圆整,分散性好,粒径分布较窄,平均粒径为(94.66±0.53)nm。以花生蛋白为原料制备纳米颗粒,不仅可拓宽花生蛋白应用领域,也为开发蛋白纳米颗粒新剂型提供一定的研究基础。

一株伪狂犬病病毒的分离及鉴定

为了从北京市周边郊区某猪场发病仔猪的脑组织中分离到伪狂犬病病毒，试验采用细胞培养、空斑纯化、PCR鉴定、动物感染试验、电镜观察的方法进行分离。结果表明：家兔接种病毒后可引起典型的伪狂犬病症状，继而死亡；PK-15细胞接种病毒出现典型细胞病变，毒价为1×10^8TCID50／mL；电镜观察可见圆形、有囊膜、直径为150～180nm大小的病毒颗粒；PCR反应可扩增出特异性长为I783bp的DNA片段。说明该分离株为猪伪狂犬病病毒野毒株。

组织化学染色与免疫电镜双标记方法在检测大鼠脑干前包钦格复合体细胞色素氧化酶活性中的应用

目的研究脑干前包钦格复合体(pre-B9t C)细胞色素氧化酶(COX)的活性变化。方法采用COX的组织化学染色与pre-B9t C的标记物神经激肽1受体(NK1R)纳米金-银加强免疫组织化学染色双标法,进行pre-B9t C特定神经核团尤其是不同亚细胞结构的COX活性检测,并进行COX活性的半定量分析。结果光镜下NK1R免疫反应性(NK1R-ir)产物主要分布于pre-B9t C神经细胞膜,清晰勾勒神经元轮廓,COX组织化学染色呈棕色,弥漫表达于NK1R-ir神经元胞质及突起内。电镜下NK1R-ir金颗粒主要分布于pre-B9t C神经元胞体和树突膜内表面,胞质内也可见金颗粒标记。pre-B9t C神经元不同亚细胞结构(胞体、轴突终末、树突)线粒体的形状和分布均有不同,在胞体和轴突终末线粒体多为圆形和椭圆形,在树突则以长杆状线粒体多见,胞体线粒体多为管泡状嵴,而板层嵴线粒体以轴突终末和树突多见。轴突终末内线粒体多聚集分布,树突内线粒体多近胞膜散在分布,但在突触部位,线粒体分布密集,且局部膨大接近突触后膜,这与突触的信息传递功能需要大量ATP产生密切相关。COX活性反应产物分布于线粒体嵴上,线粒体嵴电子密度不同表明COX活性不同。轴突终末和树突线粒体COX活性明显高于胞体。结论 pre-B9t C神经元不同亚细胞结构能量代谢不同,其中轴突终末和树突线粒体COX活性明显高于胞体,尤其突触部位线粒体分布密集,且表达高COX活性。将COX组织化学技术和免疫电镜技术相结合,为检测区域性COX活性,尤其是区域内不同亚细胞结构的COX活性提供了新方法。

铁蛋白标记抗体制备及其在免疫电镜中的应用

目的：应用铁蛋白标记技术对结肠癌细胞系 Ｃ Ｃ Ｌ２２９ 细胞膜表面抗原 Ｌ Ｅ Ａ 的分布进行电镜观察，研究其在免疫电镜中的应用。方法：利用铁蛋白二步法标记羊抗鼠 Ｉｇ Ｇ 抗体示踪 Ｃ Ｃ Ｌ２２９ 细胞表面 Ｌ Ｅ Ａ 抗原的分布。结果：在 Ｃ Ｃ Ｌ２２９ 细胞膜上有黑色铁蛋白颗粒存在，其颗粒大、反差强。结论：铁蛋白在膜表面抗原标记上有较广泛的应用，与其它电镜标记物相比具有很大的优越性。

电镜技术在病毒性肝炎诊断和研究上的应用

本文综述了电镜技术在甲、乙、丙、丁和戊型病毒性肝炎，包括新发现的数种病毒性肝炎诊断和研究上的应用情况，并简介了有关材料来源和处理及标本制备技术。资料显示，电镜技术在各型病毒性肝炎的发现，证实及病因研究上起重要作用。

透射电镜下中药制剂对耐药菌株的抑菌作用观察

目的观察中药制剂对耐药菌株的抑菌效果。方法运用中药制剂的含药血清对耐药菌株进行体外抑菌试验,通过透射电镜观察细菌超微结构的改变。结果各类耐药菌株经含药血清抑菌作用后均表现不同程度的细胞壁破损。革兰氏阳性菌的细胞壁,表现为细胞膨大,细胞壁破裂,内容物溢出等细菌结构变化;革兰氏阴性菌细胞结构不完整,胞质淡染,出现核糖体聚集成块状现象。结论中药制剂对耐药菌株具有较强的抑菌作用,为拓宽中药的用药范围,减轻耐药菌株的用药压力提供了依据。

GST-pi在大肠癌早期诊断中的价值

目的探讨谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）在大肠癌早期诊断中的价值及意义。方法应用免疫组织化学ＬＳＡＢ法，检测５４例大肠癌，１７例大肠腺瘤和３１例大肠正常粘膜中ＧＳＴ－ｐｉ的表达状态及分布特点。并应用免疫电镜技术对６例新鲜癌组织进行ＧＳＴ－ｐｉ的定位观察。结果ＧＳＴ－ｐｉ在大肠癌、腺瘤及正常粘膜中的表达阳性率分别为８１．４８％，４７．１０％和１２．９％，在不典型增生的腺瘤中阳性率高达８５．７％。大肠癌组、腺瘤组中ＧＳＴ－ｐｉ的表达均高于正常粘膜（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５），而大肠癌与不典型增生腺瘤组比较差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。结论ＧＳＴ－ｐｉ的高表达与大肠癌的发生有密切关系；ＧＳＴ－ｐｉ在不典型增生的腺瘤中的过量表达。

包埋前免疫电镜双标技术在神经解剖学研究中的应用

目的 在超微结构水平观察两种神经递质在纤维终末内的共存或一种神经递质与其相应受体之间的关系。 方法 包埋前免疫电镜双重标记技术———酶标法和免疫金 银标记法相结合的方法。 结果 在免疫反应双重标记的纹状体切片上 ,电镜下观察到大量的SP样 (过氧化物酶免疫反应产物 )阳性终末和SP受体 (SPR ,免疫金 银标记颗粒 )样阳性神经元的胞体和树突 ,同时可见部分SP样阳性轴突终末分别与SPR样阳性神经元的胞体或树突形成对称性轴 体或轴 树突触联系。而在三叉神经脊束核尾侧亚核切片上 ,电镜下可观察到大量的两种囊泡膜谷氨酸转运体 ,即DNPI样 (过氧化物酶免疫反应产物 )和VGluT1样 (免疫金 银标记颗粒 )阳性轴突终末 ,同时还观察到DNPI样和VGluT1样双标的轴突终末与阴性树突形成非对称性突触。 结论 包埋前免疫电镜双重标记技术敏感性较高 ,组织的抗原性保存好 ,特别是在神经解剖学研究中 ,用于研究两种神经递质在同一个细胞或终末内的共存或分析神经递质与其相应受体之间的联系中有独到之处。