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采用ICC-qPCR法分析渤海湾表层海水中的轮状病毒 被引量:3
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作者 明红霞 董玉波 +2 位作者 任莹利 王林同 朱琳 《海洋通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期308-313,共6页
轮状病毒是引起婴幼儿急性腹泻的重要病原体之一,在水环境中存活时间长,导致人类感染的剂量低,因此寻求一种快速高效的定量检测海水中的轮状病毒方法势在必行。传统的细胞培养技术不但耗时,而且灵敏度低,现代分子生物学技术虽然克服了... 轮状病毒是引起婴幼儿急性腹泻的重要病原体之一,在水环境中存活时间长,导致人类感染的剂量低,因此寻求一种快速高效的定量检测海水中的轮状病毒方法势在必行。传统的细胞培养技术不但耗时,而且灵敏度低,现代分子生物学技术虽然克服了上述缺点,但是其感染性的信息无从获得。因此,本文建立了细胞培养结合实时定量PCR(ICC-qPCR)的方法,并于2010年冬季对渤海湾天津近岸重点海域表层海水中具有感染性的轮状病毒进行了定量调查。500 mL海水经浓缩,48 h细胞培养之后,用qPCR方法在7个海水样品中检测出3个样品具有感染性,其测定值范围为1.8×102copies~3.8×103copies,该海域感染性轮状病毒的含量为1~39 PFU/L。ICC-qPCR方法快速、灵敏,将细胞培养与实时定量PCR技术相结合,能对感染性病毒进行定量分析,因此有望在今后的水环境胃肠道病毒的监测中得到广泛应用。 展开更多
关键词 轮状病毒 感染性 icc-qpcr 渤海湾 表层海水
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ICC-qPCR病毒灭活验证方法的建立及其应用 被引量:1
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作者 魏慧慧 段晓杰 +3 位作者 张羽 王玉梅 刘万卉 徐丽明 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期398-405,共8页
目的:建立细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(integrated cell culture quantitative PCR,ICC-qPCR)病毒灭活验证方法;结合传统细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,考察ICC-qPCR方法的适用性;利用这2种方法验证复用电生理导管环氧乙烷... 目的:建立细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(integrated cell culture quantitative PCR,ICC-qPCR)病毒灭活验证方法;结合传统细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,考察ICC-qPCR方法的适用性;利用这2种方法验证复用电生理导管环氧乙烷病毒灭活工艺的有效性。方法:通过制备指示病毒(伪狂犬病毒,PRV)质粒DNA作为定量标准品,用PRV特异性引物建立定量PCR方法;再用PRV病毒侵染宿主细胞,同时用热灭活PRV作为对照,确定PRV活病毒全部进入宿主细胞但不扩增的最佳样本收获时间,通过检测细胞中活病毒,建立ICC-qPCR活病毒检测方法;确立CPE法测定滴度与ICC-qPCR法检测DNA拷贝数之间的线性关系。最后,模拟临床使用的最坏情况对一次性电生理导管进行含指示病毒(PRV)生物污染物负载,模拟环氧乙烷病毒灭活工艺,通过ICC-qPCR和CPE法验证病毒灭活工艺的有效性。结果:本研究中建立的ICC-qPCR方法的标准曲线线性关系r2>0.99;定量下限为104 copies·μL^(-1),约相当于2 logs·mL^(-1),检测下限为103copies·μL^(-1),约相当于-1 logs·mL^(-1);特异性结果表明只能检测到PRV的扩增曲线,无非特异性扩增;重复性试验的RSD<5%。确定ICC-qPCR方法中PRV最佳收获时间为宿主细胞染毒后1~2 h。ICC-qPCR检测拷贝数与病毒滴度间具有良好的线性关系(r2>0.99)。ICC-qPCR法病毒灭活工艺验证结果表明:经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低>9.0 logs;阴性对照组(负载不含PRV生物污染物)和空白导管样品均未检出病毒DNA。CPE法的病毒滴定结果表明,经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低≥8.5 logs·mL^(-1);阴性对照组和空白导管样品均未检出PRV。结论:本研究建立的ICC-qPCR方法应用于PRV病毒灭活验证,可以有效检测活病毒,比传统CPE法(-0.5 logs·mL^(-1))灵敏度高。将此方法应用于复用电生理导管的环氧乙烷病毒灭活工艺验证,同时与CPE法进行比较,验证了ICC-qPCR方法的适用性以及环氧乙烷灭活电生理导管负载的PRV病毒的工艺有效性。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒(PRV) 病毒灭活验证 细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(icc-qpcr) 细胞病变效应(CPE) 病毒滴度 DNA拷贝数 复用电生理导管
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猪细小病毒检测ICC-qPCR替代方法的建立 被引量:2
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作者 张羽 郭佳花 +2 位作者 屈树新 段晓杰 徐丽明 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期97-103,共7页
目的:建立猪细小病毒(PPV)的细胞培养结合荧光定量PCR(ICC-qP CR)方法并进行优化,结合传统的病毒滴定(细胞培养法)及ICC-qP CR方法,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。方法:将系列10倍稀释的PPV病毒接种于猪睾丸(ST)细胞,分别扩... 目的:建立猪细小病毒(PPV)的细胞培养结合荧光定量PCR(ICC-qP CR)方法并进行优化,结合传统的病毒滴定(细胞培养法)及ICC-qP CR方法,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。方法:将系列10倍稀释的PPV病毒接种于猪睾丸(ST)细胞,分别扩增培养0、12、18、24 h,考察理想的病毒扩增培养时间,确定ICC-qP CR定量检测区间及获得病毒扩增倍数(K);将病毒平行接种于病毒扩增组及非扩增的对照组,通过扩增组和对照组的系列病毒接种量与PCR反应周期(Ct)值的拟合曲线,分别获得病毒扩增组及对照组的ICC-qP CR检测病毒滴度(T_(a)、T_(c)),结合扩增倍数(K),根据公式[Log_(10)(10^(Ta)-10^(Tc))/(K-1)]直接计算样本中的感染性病毒滴度。最后,将ICC-qP CR、优化ICC-qP CR方法和细胞培养法分别用于模拟样本(由不同比例感染性病毒和非感染性病毒组成)中的感染性病毒滴度测定,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。结果:PPV接种后的最佳扩增培养时间为24 h,检测下限为-1 LogL0~5.00 Logs_(10)TCID_(50)·100μL^(-1)(ogs),定量区间为,扩增倍数为83.11。当模拟样本中的非感染性病毒含量较低或与感染性病毒等量时,ICC-qP CR、优化ICC-qP CR方法和细胞培养法测得的感染性病毒滴度没有显著性差异;然而,当模拟样本中的非感染性病毒含量较高时,由优化的ICC-qP CR方法和细胞培养法测得的感染性病毒滴度分别是1.46、1.50 Logs,二者高度一致,而常规ICC-qP CR方法测得的结果(1.75 Logs)存在极显著性差异。结论:本研究所优化的ICC-qP CR方法作为细胞培养法的替代方法,具有用于病毒灭活验证研究的前景。 展开更多
关键词 猪细小病毒 细胞培养结合荧光定量PCR方法 替代方法 扩增倍数 病毒灭活验证 病毒滴定 非感染性病毒 假阳性信号
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空气净化装置病毒净化效率试验中病毒滴度测定方法比较
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作者 马向东 叶智坚 +3 位作者 张文欢 覃芳敏 赵爽 朱吉兴 《中国消毒学杂志》 CAS 2024年第5期327-329,334,共4页
目的比较3种不同病毒滴度测定方法在通风系统用空气净化装置病毒净化效率试验中的适用性。方法采用气溶胶染菌,分别使用噬斑法、定量聚合酶链反应法(qPCR)和结合细胞培养的qPCR法(ICC-qPCR)3种病毒滴度测定方法,对5款不同类型空气净化... 目的比较3种不同病毒滴度测定方法在通风系统用空气净化装置病毒净化效率试验中的适用性。方法采用气溶胶染菌,分别使用噬斑法、定量聚合酶链反应法(qPCR)和结合细胞培养的qPCR法(ICC-qPCR)3种病毒滴度测定方法,对5款不同类型空气净化装置的一次净化效率进行对比。结果高压静电净化装置、初效过滤器、中效过滤器的净化效率,3种方法检测结果无统计学差异(P>0.01);紫外线净化装置和高效过滤器的净化效率,qPCR法的检测灵敏性高于与其他2种方法(P<0.01),ICC-qPCR法耗时最短(约5 h),重复性好,RSD值小于其他2种方法,最低为0.01%。结论ICC-qPCR法适用范围广、用时短、结果稳定性高,适用于通风系统用净化装置病毒净化效率的评价。 展开更多
关键词 通风系统 净化装置 净化效率 噬菌体MS2 噬斑法 qPCR法 icc-qpcr
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水中肠道病毒检测方法的分析评价
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作者 徐丽梅 王晓昌 +3 位作者 周进宏 徐丽华 吉铮 张崇淼 《环境工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期978-984,共7页
采用Hep-2细胞分离培养水中的肠道病毒,根据肠道病毒5’-UTR核酸的保守区,建立了一种细胞培养与实时荧光定量PCR(ICC-RT-q PCR)联合检测感染性肠道病毒的方法。对RT-q PCR、TCID50和ICC-RT-q PCR 3种检测方法进行灵敏度、相关性分析,... 采用Hep-2细胞分离培养水中的肠道病毒,根据肠道病毒5’-UTR核酸的保守区,建立了一种细胞培养与实时荧光定量PCR(ICC-RT-q PCR)联合检测感染性肠道病毒的方法。对RT-q PCR、TCID50和ICC-RT-q PCR 3种检测方法进行灵敏度、相关性分析,评价RT-q PCR、ICC-RT-q PCR用于估计水中感染性病毒含量的可行性。结果表明,RT-q PCR方法高估了水中病毒的感染性。肠道病毒低浓度(4.4×10-1-4.4×10^3TCID50/m L)时TCID50与ICC-RT-q PCR线性关系良好,相关系数R2=0.99。水样经浓缩,ICC-RT-q PCR检测病毒含量为1.0×10^3-3.2×104copies/L,估计含量为3-30 TCID50/L,与病毒感染性11-29 TCID50/L结果相近,检出率为83.3%。高于TCID50的检测结果(33.3%)。因此,ICC-RT-q PCR方法快速、灵敏,可对水中感染性肠道病毒进行准确的定量分析。 展开更多
关键词 肠道病毒 感染性 TCID50 RT-QPCR ICC-RT-qPCR
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Evaluation of the infectivity,gene and antigenicity persistence of rotaviruses by free chlorine disinfection 被引量:2
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作者 Dan Li April Z. Gu +3 位作者 Siyu Zeng Wan Yang Miao He Hanchang Shi 《Journal of Environmental Sciences》 SCIE EI CAS CSCD 2011年第10期1691-1698,共8页
The effects of free chlorine disinfection of tap water and wastewater effluents on the infectivity, gene integrity and surface antigens of rotaviruses were evaluated by a bench-scale chlorine disinfection experiments.... The effects of free chlorine disinfection of tap water and wastewater effluents on the infectivity, gene integrity and surface antigens of rotaviruses were evaluated by a bench-scale chlorine disinfection experiments. Plaque assays, integrated cell culture-quantitative RT- PCR (ICC-RT-qPCR), RT-qPCR, and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), respectively, were used to assess the influence of the disinfectant on virus infectivity as well as genetic and antigenic integrity of simian rotavirus SA11 as a surrogate for human rotaviruses. The ICC-RT-qPCR was able to detect rotaviruses survival from chlorine disinfection at chlorine dose up to 20 mg/L (60 min contact), which suggested a required chlorine dose of 5 folds (from 1 to 5 mg/L) higher than that indicated by the plaque assay to achieve 1.8 log10 reductions in tap water with 60 rain exposing. The VP7 gene was more resistant than the infectivity and existed at chlorine dose up to 20 mg/L (60 min contact), while the antigencity was undetectable with chlorine dose more than 5 mg/L (60 min contact). The water quality also impacted the inactivation efficiencies, and rotaviruses have a relatively higher resistant in secondary effluents than in the tap water under the same chlorine disinfection treatments. This study indicated that rotaviruses have a higher infectivity, gene and antigencity resistance to chlorine than that previously indicated by plaque assay only, which seemed to underestimate the resistance of rotaviruses to chlorine and the risk of rotaviruses in environments. Present results also suggested that re-evaluation of resistance of other waterborne viruses after disinfections by more sensitive infectivity detection method (such as ICC-RT-qPCR) may be necessary, to determine the adequate disinfectant doses required for the inactivation of waterborne viruses. 展开更多
关键词 ROTAVIRUSES free chlorine disinfection infectivity genes ANTIGENICITY ICC-RT-qPCR
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