赤桉eca-miRn33及其靶基因EcaICE1的鉴定与表达分析

以赤桉组培苗为材料,通过PCR扩增eca-miRn33前体基因序列,结合5′RLM-RACE和烟草瞬时表达分析其对靶基因EcaICE1的剪切特征,并利用实时荧光定量PCR分析叶片和茎干中eca-miRn33与靶基因EcaICE1在低温胁迫下的表达模式。结果显示:赤桉eca-miRn33前体基因序列全长60 bp,可形成典型的发卡结构,eca-miRn33成熟序列位于其前体的5′端;5′RLM-RACE和农杆菌介导的烟草瞬时表达试验结果表明eca-miRn33可靶向剪切EcaICE1;eca-miRn33表达量与EcaICE1表达量之间呈显著负相关。

转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究

ICE1是CBF冷响应通道的上游转录调控因子,通过与CBF启动子中MYC顺式作用元件的结合激活CBF3基因表达。采用RT-PCR方法,从拟南芥获得AtICE1基因,将AtICE1导入pCAMBIA1301构建35S∷AtICE1植物表达载体。通过根癌农杆菌GV3101,将AtICE1基因导入烟草,T1代植株经潮霉素抗性筛选,PCR、RT-PCR检测,结果表明AtICE1基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平表达;在正常生长条件下,转基因烟草与对照烟草的生长未见明显区别,而在瞬时低温冻害下,转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株,说明AtI-CE1基因可以提高低温敏感作物的耐寒性。

萝卜ICE1密码子使用偏性分析

为了解萝卜ICE1密码子的使用特性,运用CUSP和Codon W软件程序分析萝卜ICE1密码子的使用偏好性,并与芜菁等10种植物ICE1、萝卜基因组样本及拟南芥等基因组密码子偏性进行比较。结果表明,萝卜ICE1密码子偏好以A/T结尾;根据RSCU值,确定萝卜ICE1高频密码子有12个;与萝卜基因组密码子相比,19个密码子的偏好性相同;与其他物种同源基因相比,密码子选择偏性存在差异;聚类分析中,基于ICE1编码序列的聚类结果比密码子使用偏性分析更能准确地反映物种间的亲缘关系;与其他物种基因组密码子使用频率比较发现,同科物种(拟南芥、甘蓝)差异较小,与水稻差异较大,预示着萝卜ICE1在异源表达时尚需进行适当的改造和优化。萝卜ICE1密码子偏性分析为萝卜ICE1的异源表达及分子遗传研究提供了一定的理论依据。

盐芥ICE1转录因子的克隆及生物信息学分析

ICE1基因编码一个MYB类型的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,在冷胁迫条件下调节CBF基因的表达,能够提高植物抗寒性。利用盐芥5′EST序列和拟南芥ICE13′UTR保守序列设计引物,从盐芥基因组中克隆得到了1个2525bp的基因xhICE。生物信息学分析,表明该基因具有4个外显子,4个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。由此推导的cDNA包含一个1500bp的开放阅读框,编码500个氨基酸。与拟南芥ICE1相比,二者的内含子具有相同的类型和相对保守的位置,在核酸水平与氨基酸水平高度同源,并且具有相同的bHLH结构域。以上分析都表明,xhICE基因可能是盐芥ICE1基因,涉及抗寒相关的CBF转录调控途径。

农杆菌介导的转ICE1基因提高水稻的耐寒性

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将通过RT-PCR克隆的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传。抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照。脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照。上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。

利用冷诱导表达ICE1载体提高烟草抗寒性

利用拟南芥克隆转录激活因子ICE1和RD29A启动子,将ICE1连上RD29A启动子,构建成冷诱导植物表达载体pBin-RD29ICE1,通过农杆菌介导法转化烟草,获得了99棵抗性转基因再生烟草植株。通过PCR鉴定44%为阳性,将PCR检测到的44棵阳性植株进行Southern杂交检测,80%为阳性。转基因与野生型烟草同时经受低温处理,前者抗寒性明显提高。

油菜ICE1基因表达载体构建及转化烟草

从油菜中克隆得到了ICE1基因的开放阅读框序列.构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体,经农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株.通过PCR检测,目的基因成功转入烟草中.将转油菜ICE1基因的烟草和非转基因烟草置于2℃处理7 d,非转基因烟草出现萎蔫,转基因烟草没有明显变化,非转基因烟草丙二醛浓度明显高于转基因烟草.将转基因烟草与非转基因烟草分别置于0、-2、-4℃各1 h后,转基因烟草APX、SOD活性明显高于非转基因烟草.

农杆菌介导的ICE1基因转化番茄的研究

以番茄品种组培大黄为试验材料,通过农杆菌介导法,将来自拟南芥的抗寒基因ICE1导入番茄,并对影响遗传转化的因素进行了优化。结果表明,高效稳定的遗传转化体系培养基为MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L;子叶预培养2d,农杆菌菌液浓度OD600=0.4,侵染10min,共培养36h,抑菌抗生素300mg/L。获得抗性植株5株,PCR扩增和RT-PCR检测表明有3株阳性植株,转化率为60%,初步表明ICE1基因已导入到番茄中。

拟南芥抗寒基因ICE1的克隆及功能分析

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进化树表明,拟南芥ICE1基因与其他物种的ICE1基因差别较大。用农杆菌介导法得到4株阳性烟草植株,Southern blotting检测证明,ICE1基因已经以单拷贝的形式整合到烟草基因组中。实时荧光定量PCR检测表明,ICE1基因在转基因烟草植株的根、茎和叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量最高。4℃低温环境下,与未转化植株相比,转ICE1基因烟草植株叶片的相对电导率降低了12.00%~17.65%,脯氨酸含量增加了13.28%~24.10%,丙二醛含量减少了7.09%~14.52%,过氧化物酶活性提高了9.39%~22.54%。【结论】克隆获得了拟南芥ICE1基因的完整开放阅读框序列,在烟草中转入ICE1基因可提高其耐寒性。

ICE1基因表达载体的构建及对番茄的转化

以pCAMBIA3301质粒为基础,构建了由CaMV35S启动子调控的ICE1基因植物表达载体p3301-ICE1。重组质粒通过农杆菌介导转化番茄品种组培大黄经卡那抗性鉴定,获得5株含ICE1基因的番茄抗性植株,PCR扩增和RT-PCR检测结果表明,其中3株为阳性植株,转化率为60%。转ICE1基因的番茄植株经4℃低温胁迫72h后,与对照植株相比,MDA含量明显降低,Pro含量、POD和CAT活性明显升高。

低温胁迫下转ICE1基因水稻养分变化的研究

采用盆栽试验,选用转ICE1基因水稻T4-8株系和T4-9株系及未转基因水稻(Oryza sativa L.)品种垦鉴稻10号为试验材料,研究苗期低温胁迫对转基因水稻氮、磷、钾养分吸收的影响。结果表明,低温胁迫期间,转基因水稻幼苗丙二醛含量维持在较低水平,SOD活性维持在较高水平;地上部分氮、磷、钾含量变化不大,一直维持在较高水平;地下部分氮、磷、钾含量呈缓慢下降趋势,但降幅比非转基因水稻小,在胁迫第10天,T4-8株系和T4-9株系氮含量均高出对照13.86%,磷含量分别高出42.31%和50.00%,钾含量均高出85.71%。说明在低温胁迫条件下,ICE1基因过量表达可以增强水稻的抗寒性,减轻低温对水稻的伤害,保持根系较强的吸收养分能力。

转rd29A-ICE1冷诱导基因水稻提高抗寒性研究

本研究以pCAMBIA1300质粒为基础,构建了植物冷诱导表达载体pCAMBIA1300-rd29A-ICE1,利用农杆菌介导法导入粳稻品种空育131中。PCR、RT-PCR和Southern杂交检测结果表明,ICE1基因已经成功整合到水稻基因组中,并正常表达。与对照相比,低温处理后超表达ICE1基因的水稻转基因株系存活率和脯氨酸含量明显增加,丙二醛含量积累速率明显下降,提高了抗低温胁迫能力。

橄榄CaICE1基因的克隆和表达分析

为了解橄榄(Canarium album)抗寒相关转录因子ICE1的调控功能,采用RT-PCR技术克隆了‘福榄1号’的ICE1,命名为CaICE1,并进行生物信息学、qRT-PCR表达模式和相关miRNA预测分析。结果表明,CaICE1 cDNA序列的开放阅读框长度为1 650 bp,可编码549个氨基酸(GenBank登录号MG459422)。Ca ICE1为不稳定亲水性蛋白质,含有跨膜结构、磷酸化位点以及HLH保守结构域,定位于细胞核,与枳的ICE1亲缘关系较近。CaICE1密码子偏好性较弱,AGA、AGG、TGG和CCA可能为其最优密码子群。CaICE1主要在橄榄花、种子和叶中大量表达,-3℃低温胁迫下CaICE1表达水平比常温显著上升。psRNAtarget预测结果表明,CaICE1可能是miR825、miR477、miR5658、miR1436和miR394等多个逆境响应miRNA的靶基因。因此,CaICE1可能在橄榄低温胁迫过程中发挥重要调控作用,且可能受miRNA的调控。

农杆菌介导的大花蕙兰转ICE1基因

大花蕙兰属热带植物,在北方组培成本很高,从拟南芥的RNA中克隆到耐寒基因(COR)的转录激活因子ICE1,连上CaMV35S启动子构建成植物表达载体pCAM BIA1300-35S-ICE1-poly,通过农杆菌介导的方法转化大花蕙兰。经过抗性筛选、诱导生芽、诱导生苗、诱导生根等过程,获得了70多棵潮霉素抗性植株,PCR鉴定12.9%为阳性,且部分PCR阳性植株通过了Southern检测,确定为转基因植株。

植物抗寒转录激活因子ICE1和ICE2基因的生物信息学分析

从美国在线数据库(NCBI)中获得不同植物ICE1和ICE2基因的完整序列并对其进行分析,以期对ICE基因的结构与生物学功能研究提供理论基础。利用Clustal W2和Mega 5.0软件对其基因的氨基酸序列进行多重比对和系统发育树构建,并采用不同的生物信息手段对其蛋白的一、二、三级结构进行分析。结果表明:ICE1和ICE2基因均含有4个不同的结构域,即富S区、核定位信号区(NLS)、bHLH结构域和转膜区,但其bHLH结构域和富S区(单子叶植物间)存在差异。ICE1和ICE2基因编码的氨基酸主要是脂肪族类氨基酸,以丝氨酸(Ser)和亮氨酸(Leu)为主,其等电点均呈酸性,等电点值均是单子叶>双子叶,ICE1和ICE2均为亲水性不稳定蛋白。C和H为ICE1和ICE2蛋白二级结构的主要元件,E和T只是零星分布在整个蛋白中,且H、T、E、C的含量均存在差异,其含量及折叠方式的差异导致蛋白三级结构的不同。ICE1和ICE2基因在基因序列上有相似的结构域,但其蛋白结构存在差异。

植物耐寒基因ICE1的克隆

通过对耐寒相关基因进行转基因,可以提高植物的耐寒性。为使烟草提高耐寒性,本研究根据GeneBank中公布的ICE1序列设计引物,以拟南芥cDNA为模板克隆了植物耐寒基因ICE1(全长1485bp),经PstI酶切检测克隆到的ICE1序列和GeneBank公布的一致。为我们下一步构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草奠定了基础。

低温胁迫对转ICE1基因水稻抗氧化酶系统的影响

[目的]研究低温胁迫对转ICE1基因水稻抗氧化酶系统的影响。[方法]以水稻空育131及其转ICE1基因水稻T1-16及T1-24株系为材料,低温处理水稻幼苗0～2 d,测定其抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性及可溶性蛋白质含量。[结果]经低温处理后,转基因水稻和非转基因水稻的抗氧化酶活性和可溶性蛋白质含量在变化幅度方面有明显的差异,低温处理2 d后,对照植株抗氧化酶活性和可溶性蛋白质含量均开始下降,而转基因水稻SOD、POD活性和可溶性蛋白质含量高于对照,且仍继续升高。[结论]试验结果表明转入ICE1基因确实提高了水稻的抗寒性。

越橘低温响应因子VcICE1的克隆和功能鉴定

为挖掘越橘低温胁迫响应基因在低温逆境胁迫应答中的作用,探讨越橘低温逆境胁迫响应机制,以北陆越橘为试材,克隆低温响应基因 VcICE1 (Inducer of CBF3 expression 1),分析其表达模式及对低温的响应,探讨 VcICE1 在抵御低温胁迫中的生物学功能。利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥对低温胁迫响应的差异。利用瞬时转化烟草叶片试验,分析VcICE1对 AtCBF3 的转录调控。结果表明,克隆获得越橘低温响应因子 VcICE1 ,该基因ORF为1 566 bp,编码含有522个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的bHLH结构域。系统进化分析表明,VcICE1与AtICE1同源性最高。表达分析显示, VcICE1 在根、枝条、幼叶、花和果实中均表达,在幼叶中表达量最高,在果实中最低,并响应低温处理。在拟南芥中异位表达 VcICE1 ,其低温抗性较野生型显著升高。瞬时表达试验结果表明,VcICE1可激活 AtCBF3 的表达。 VcICE1 能够对低温处理有明显响应,推测其在响应低温胁迫过程中发挥重要的调控作用。

梅花PmICE1基因的克隆及低温条件下的表达

以梅花(Prunus mume)品种‘三轮玉蝶’为试材,根据苹果(Malus domestica)MdCIbHLH1基因序列在梅花基因组数据库中搜索同源序列并设计引物,通过PCR、RT-PCR获得ICE1基因的DNA、cDNA全长序列。cDNA全长1 626 bp,含有完整的开放阅读框,编码541个氨基酸,基因编码区上存在3个内含子和4个外显子,含有bHLH区、富S区、核定位信号区(NLS)和转膜区。ExSAPy在线预测编码蛋白呈亲水性,亚细胞定位预测目的蛋白位于细胞核(98%)。BLAST分析结果表明,其cDNA序列及推导的氨基酸序列均与苹果、茶(Camellia sinensis)、甜杨(Populus suaveolens)、枳(Poncirus trifoliata)等物种的ICE1具有较高同源性,推断克隆到的cDNA可能是梅花ICE1基因,命名为PmICE1。实时荧光定量分析结果表明,在4℃低温胁迫下,PmICE1基因表达量随胁迫时间的延长呈上升趋势,16 h时达到峰值,说明该基因在低温胁迫下呈上调表达。

ICE1-CBF信号通路在植物抵御低温胁迫和调控发育过程中的作用研究进展

低温作为重要的环境因子影响着植物的地理分布和物种多样性,并且对农业可持续发展造成了严重的威胁。ICE1(INDUCER OF CBF EXPRESSION1)-CBF(C-REPEAT-BINDING FACTOR)信号通路不仅在植物抵御低温胁迫的过程中发挥着关键作用,也在植物调控生长发育的过程中也扮演着重要角色,对ICE1-CBF调控机理的了解有助于深入认识植物如何在逆境条件下平衡生长与生存之间的关系。该文对近年来国内外有关ICE1-CBF通路在低温信号转导中的精细调控过程的研究进展进行了综述,并重点对ICE1-CBF在调控植物发育中的作用进行了讨论。