ICG-001对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制

目的:检测小分子抑制剂ICG-001对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用并探讨其分子机制。方法:使用50和100μmol/L的小分子抑制剂ICG-001处理食管鳞癌细胞系KYSE410和KYSE450,以溶剂DMSO处理细胞作为对照,进行细胞增殖活力、集落形成能力、细胞周期分布及凋亡检测;分别使用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测ICG-001处理细胞中相关分子(SKP2、Survivin和TCF4)mRNA和蛋白水平的表达变化。结果:与对照组比较,ICG-001处理可显著抑制食管鳞癌细胞系KYSE410和KYSE450的增殖活力和集落形成能力,并可显著诱导细胞发生G0/G1期阻滞(P<0.01);SKP2、Survivin和TCF4的m RNA和蛋白表达水平在ICG-001处理组均显著降低(P<0.01)。结论:ICG-001可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖活力和集落形成能力,并可诱导细胞发生G0/G1期阻滞,该作用可能与其抑制β-catenin/TCF4的转录活性及其下游分子Survivin和SKP2的表达有关。

Wnt/β-catenin信号通路在肾缺血再灌注大鼠中的表达及ICG-001阻断对慢性肾间质纤维化的作用

目的观察Wnt/β-catenin信号通路在肾缺血再灌注大鼠模型中不同时间的表达及ICG-001阻断Wnt/β-catenin信号通路对慢性肾间质纤维化的作用。方法将SD大鼠分为4组,假手术组(Sham)、IRI 7 d组、IRI 14 d组及ICG+IRI组。假手术组不夹闭左侧肾动脉;IRI 7 d组、IRI 14 d组及ICG+IRI组用无创血管夹夹闭左侧肾动脉,35 min后去除血管夹;ICG+IRI组于术后第2天开始腹腔注射ICG-001。检测4组大鼠肾功能,Western blot检测肾组织β-链蛋白(β-catenin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平,免疫组化观察β-catenin表达部位,生化染色测胶原含量,Masson染色观察病理改变。结果与假手术组相比,IRI 7 d组Fibronectin、α-SMA、胶原含量无明显增高,病理无明显肾小管间质纤维化;而IRI 14 d组Fibronectin、α-SMA的蛋白表达水平则明显增高,胶原含量增多,肾功能减退,病理显示肾小管间质纤维化。与假手术组相比,IRI 7 d组β-catenin表达增高,IRI 14 d组较IRI 7 d组增高更显著。与IRI 14 d组相比,ICG+IRI组β-catenin、Fibronectin、α-SMA的蛋白表达水平明显降低,胶原含量减少,肾功能好转,病理显示肾小管间质纤维化程度减轻。结论 Wnt/β-catenin信号通路在IRI术后7 d已激活,早于肾间质纤维化出现;ICG-001阻断Wnt/β-catenin信号通路可减轻肾缺血再灌注所致慢性肾间质纤维化。

ICG-001在肝癌中对凋亡抑制蛋白Survivin的影响

目的探讨β-catenin抑制剂ICG-001对SD大鼠肝癌组织中凋亡抑制蛋白Survivin的影响。方法予二乙基亚硝胺喂养SD大鼠,随后将已成瘤的大鼠分成对照组、DMSO组和给药组。用ICG-001抑制β-catenin的表达,Western blot法检测ICG-001对大鼠肝癌组织中Survivin蛋白表达的影响;实时定量PCR法检测ICG-001对肝癌组织中Survivin mRNA的影响。结果用ICG-001抑制β-catenin的表达后,Western blot结果显示,ICG-001给药后Survivin的蛋白表达量降低。实时定量PCR结果显示,ICG-001给药后Survivin mRNA表达量降低。结论β-catenin抑制剂ICG-001明显抑制Survivin的蛋白表达及mRNA表达。

ICG-001对大鼠孤独症样行为及海马树突棘形态发育的影响

目的探讨ICG-001对大鼠孤独症样行为及海马锥体神经元树突棘形态发育的影响。方法健康雌性Wistar大鼠自然受孕,出生子代大鼠依据随机数字表法分为4组:生理盐水对照组、ICG-001对照组、丙戊酸钠(VPA)组和ICG-001处理组。每组12只。运用三箱社交、埋珠、旷场和高架十字迷宫实验检测大鼠社交、重复刻板和焦虑样行为。应用免疫荧光检测大鼠海马CA1区神经特异核蛋白(NeuN)阳性神经元数目。高尔基染色法观察大鼠海马锥体神经元树突棘密度和形态改变。Western blot检测大鼠海马磷酸化LIM激酶1(LIMK1)、肌动蛋白结合蛋白(Cofilin)、纤维状肌动蛋白(F-actin)和脑发育调节蛋白A(Drebrin A)蛋白表达。采用单因素方差分析统计学差异,以Tukey法进行组间比较。结果1.三箱社交行为实验:生理盐水对照组、ICG-001对照组、VPA组和ICG-001处理组与新奇大鼠接触时间分别为(219.42±5.38)s、(218.67±10.12)s、(126.58±5.02)s、(218.58±6.63)s,偏好指数分别为0.43±0.05、0.43±0.04、0.22±0.01、0.42±0.04;与VPA组相比,ICG-001处理组接触时间及偏好指数均显著增加(均P<0.05)。2.埋珠实验:4组大鼠埋珠数量分别为(9.13±0.52)个、(9.08±0.64)个、(15.13±0.82)个、(9.42±0.86)个;与VPA组相比,ICG-001处理组埋珠数量显著减少(P<0.05)。3.旷场实验:4组大鼠的中央区域停留时间分别为(82.33±1.83)s、(81.32±4.19)s、(45.51±3.02)s、(81.44±3.19)s;与VPA组相比,ICG-001处理组中央区域停留时间明显增加(P<0.05)。4.高架十字迷宫实验:4组大鼠在开臂停留时间分别为(107.75±7.23)s、(106.08±7.50)s、(63.42±1.91)s、(106.67±7.07)s;与VPA组相比,ICG-001处理组在开臂停留时间显著增加(P<0.05)。5.免疫荧光实验:4组大鼠海马CA1区NeuN阳性神经元数量分别为(41.83±1.17)×10^(4)/μm^(2)、(41.00±0.77)×10^(4)/μm^(2)、(27.17±0.95)×10^(4)/μm^(2)、(40.00±0.90)×10^(4)/μm^(2);与VPA组相比,ICG-001处理组NeuN阳性神经元数量明显较多(P<0.05)。6.高尔基染色实验:4组大鼠海马CA1区锥体细胞树突棘密度分别为(0.74±0.04)个/μm、(0.73±0.03)个/μm、(0.49±0.03)个/μm、(0.70±0.02)个/μm,其中蘑菇型顶树突棘所占百分比(0.49±0.02)%、(0.49±0.02)%、(0.33±0.02)%、(0.43±0.02)%,瘦长型顶树突棘所占百分比(0.27±0.02)%、(0.26±0.02)%、(0.34±0.01)%、(0.26±0.01)%。与VPA组相比,ICG-001处理组海马CA1区锥体细胞顶树突棘密度明显增加(P<0.05),蘑菇型树突棘增多和瘦长型顶树突棘减少(均P<0.05)。7.Western blot实验:4组大鼠海马磷酸化LIMK1/LIMK1比值分别为100.33±2.30、99.34±2.28、57.76±4.10、99.13±1.90,磷酸化Cofilin/Cofilin比值分别为100.18±2.43、100.18±1.70、57.12±1.88、99.53±1.69,F-actin/球状肌动蛋白(G-actin)比值分别为100.07±0.86、99.99±1.72、51.19±1.23、99.28±3.17,Drebrin A蛋白相对表达量分别为100.79±1.19、100.12±2.04、52.86±3.26、99.97±2.44;与VPA组相比,ICG-001处理组显著上调了海马中磷酸化LIMK1、Cofilin、F-actin和Drebrin A表达(均P<0.05)。结论ICG-001可能通过调控LIMK1/Cofilin信号通路,促进F-actin形成和上调Drebrin A表达,增强树突棘形态发育,进而改善大鼠孤独症样行为。

Wnt抑制剂ICG-001对常染色体显性遗传多囊肾病模型的作用

目的探究ICG-001在体内外模型中对常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)的影响。方法用体外囊泡实验模型,将MDCK细胞分为对照组和低、中、高剂量实验组(0.2,1.0和5.0μmol·L^(-1)),跟踪定位囊泡,拍照、测量囊泡直径,并计算囊泡生成率。根据实验结果,进一步用胚胎肾囊泡模型,确定药物对于胚胎肾囊泡的作用。用Ksp-Cre;Pkd1fl/fl(Pkd1在肾组织特异性敲除)多囊肾小鼠模型,将小鼠随机分为模型组、对照组和实验组(5 mg·kg^(-1) ICG-001)。通过比较小鼠的肾重指数和组织学结果,观察药物对于体内多囊肾的治疗效果。结果体外囊泡模型实验结果显示,ICG-001可以抑制由佛司可林刺激增长的MDCK细胞囊泡,且呈剂量相关性;胚胎肾囊泡模型显示,实验组中ICG-001处理的胚胎肾与对照组相比,明显存在凋亡现象;在多囊肾小鼠模型中,实验组小鼠的肾重指数(双侧肾与体重的百分比)及苏木精-伊红染色结果与模型组小鼠相比,差异均无统计学意义。结论ICG-001在体外囊泡模型中能够抑制囊泡的发生和发展,但ICG-001会抑制胚胎肾的发育,并且无法治疗已发病小鼠的肾囊肿,因而无法作为治疗ADPKD的药物。