质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

目的应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法以pLL3．7质粒为模板,采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段,连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNAR1和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT- PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2,定向克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上,构建HCMV AD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP- C1-IE2;用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中,荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用,并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果三组质粒重组体构建成功,克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1:1和1:2时,其中pMD-T-shRNAR1 48～72 h间干涉效应为100％,可完全封闭IE2的表达;pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达,48-72 h间干涉效应达到98．4％～99％。结论通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMV IE2基因的表达,为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。

人巨细胞病毒感染及其IE86蛋白对ARPE-19细胞周期的影响

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染ARPE-19细胞后对其细胞周期的影响,观察这种变化与HCMVIE2基因的关系,探讨HCMV感染的发病机制。方法用HCMV感染同步化的ARPE-19作为感染组,同时设模拟感染组为对照组。于感染后第1、2、3、4、5天收获细胞,RT-PCR方法检测HCMV IE mRNA的表达水平,用免疫荧光法检测细胞核内HCMV IE蛋白的表达,Western blot法检测HCMV早期蛋白IE和晚期蛋白pp65的表达。采用PCR方法从质粒pIEP86AD169扩增出IE2片段,构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,脂质体介导瞬时转染ARPE-19细胞,RT-PCR、免疫荧光法分析IE2基因的表达。流式细胞术检测细胞周期的变化。结果 HCMV IE72、IE86和pp65可分别在病毒感染ARPE-19细胞后第2、3和5天时检测到表达,流式细胞术示感染组在感染第3、4、5天细胞周期的S期细胞比例显著增高,与对照组比较差异均有显著性统计学意义,P(0.05。瞬时转染质粒pEGFP-N3-IE2后细胞周期表现为S期细胞比例显著增高。结论 ARPE-19是HCMV的允许细胞,HCMV可引起ARPE-19细胞周期的改变,这种变化与IE2基因的表达有一定的关系。