IER5基因对HeLa细胞辐射敏感性的影响

为寻找放射敏感性基因,采用基因芯片技术筛选出辐射可诱导表达mRNA上调的基因,其中就有IER5.为探索IER5基因的生物学功能及其在宫颈癌放疗中的作用,采用RNA干扰技术构建IER5基因表达抑制的质粒载体并构建IER5-siRNA-HeLa细胞系.对该细胞系与HeLa细胞进行辐射,旨在了解IER5-siRNA-HeLa的细胞生长曲线、细胞周期等实验参数的变化,揭示了IER5基因在辐射诱导中的生物学功能.实验发现,IER5基因表达抑制可提高细胞分裂进入S期与G2-M期的比例,促进细胞分裂,促进细胞生长,提高细胞对辐射的拮抗性,同时发现IER5-siRNA-HeLa细胞在尺寸上大于HeLa细胞.研究表明,IER5基因表达抑制可促使细胞受辐射后发生S期与G2-M期的阻滞,IER5参与辐射细胞周期的调控,对临床宫颈癌放疗有一定的潜在应用价值.

利用RNA干扰技术构建IER5-SiRNA-Hela细胞系

目的观察小干扰RNA(siRNA)转染Hela细胞后,对IER5基因抑制效果,筛选出高效的siRNA转染质粒。方法利用siRNA设计软件,将设计好的RNA片断插入到siRNA表达质粒载体PsilencerTM 3.1-H1 hygro中,测序正确后转染至Hela细胞中。利用Real-time PCR的方法 ,测定siRNA对Hela细胞中IRE5的抑制效果。结果在mRNA水平及Western blot测试,IER5-siRNA-Hela细胞的IER5基因mRNA表达抑制效果明显。从细胞形态上讲,IER5-siRNA-Hela细胞与正常Hela细胞相比,IER5-siRNA-Hela细胞比Hela细胞体积大。结论本实验成功的获得了特异性抑制IER5基因的IER5-siRNA-Hela细胞系。

辐射介导下HeLa细胞中Cdc25B与IER5蛋白表达的关系

目的:探索辐射介导下He La细胞中Cdc25B与IER5蛋白表达的关系。方法:用4 Gyγ射线分别照射正常He La细胞和IER5-si RNA-He La细胞,收集照射后0、0.5、2、4、8、12、16、24、36 h的细胞样本,并设未照射细胞为对照组。采用q PCR法检测照射后Cdc25B m RNA的表达;Western blot检测细胞内IER5和Cdc25B蛋白的表达;流式细胞术检测照射后G2期细胞周期阻滞情况。结果:q PCR结果显示,照射后0.5~24 h内,与对照组相比,正常He La细胞内Cdc25B m RNA在0.5 h先下降2 h再上升之后再下降,差异均有统计学意义(P均<0.05);在IER5-si RNA-He La细胞内Cdc25B m RNA在0.5 h先下降后再上升,差异均有统计学意义(P均<0.05,2 h组除外)。Western blot结果显示,照射后0.5~24 h内,与对照组相比,正常He La细胞内Cdc25B蛋白从2 h开始上升8 h开始下降,差异有统计学意义(P均<0.01);IER5-si RNA-He La细胞内Cdc25B蛋白从0.5 h开始下降8 h开始逐渐上升,差异有统计学意义(P均<0.01,24 h除外)。照射后0~36 h内,与对照组相比,正常He La细胞与IER5-si RNA-He La细胞的IER5蛋白表达水平分别在照后8 h与0 h后开始出现明显上升,差异均具有统计学意义(P均<0.05);而Cdc25B蛋白表达水分别在照射后8 h与0 h后开始出现下降,差异均具有统计学意义(P均<0.05),正常He La细胞与IER5-si RNA-He La细胞中Cdc25B蛋白与IER5蛋白的表达分别从8 h与0 h后开始呈现负相关关系(r分别为-0.740和-0.669,P均<0.01),当两种细胞中Cdc25B蛋白表达量下降时,G2期细胞周期阻滞比例升高(P<0.05)。结论:辐射介导下He La细胞中Cdc25B蛋白表达变化是由Cdc25B m RNA变化引起的,并且Cdc25B与IER5蛋白表达呈负相关关系。

IER5在宫颈癌中的表达、功能富集、信号通路和预后关系生物信息分析

目的探讨IER5在宫颈癌中的表达及其临床意义。方法在TCGA数据库中检索分析IER5基因在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达情况;采用GO和KEGG对IER5基因进行功能分析,STRIGN数据库构建IER5相关蛋白作用网络(PPI)。结果在宫颈癌组织中IER5基因mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05);IER5蛋白间相互作用关系edge=67,区域聚类指数为0.67,蛋白作用网络富集显著(P<0.05);PPP1R13L基因与IER5正向相关表达最为显著(r=0.6397,P<0.05)。而PLCH1基因与IER5负相关表达最为显著(r=-0.553,P<0.05)。IER5基因相关信号通路主要富集于细胞紧密连接、人乳头瘤病毒感染、PI3K-Akt等信号通路。预后分析提示IER5基因mRNA高表达患者总生存期低于低表达组(HR=1.8,P=0.013);但高低表达组无疾病进展生存期无统计学差异(HR=1.4,P=0.26)。结论IER5在宫颈癌中高表达,并与患者的TNM分期、淋巴结转移及预后有关。

γ射线照射对IER5基因mRNA表达的影响

目的应用实时PCR技术分析^60Coγ射线照射正常人淋巴母细胞（AHH1）、宫颈癌细胞（HeLa）与接种人肿瘤细胞的裸鼠后IER5基因表达的影响。方法对于离体培养的AHH1、HeLa与BALB／c—nu裸鼠，按照不同剂量（0．5、2、4、6、10、15Gy）与照射后不同时间点（2、4、8、12、24h）进行分组进行提取mRNA、反转录与IER5基因表达量测试。结果在相同条件下AHH1对照射比HeLa更灵敏，其表达量的峰值对应的剂量比HeLa的要低。对于AHH1细胞，对2Gy低剂量的照射反应比10Gy的高剂量反应要快，而HeLa细胞，对于2Gy的低剂量与10Gy的高剂量的照射反应没有太大差异，在照射后2h都出现基因表达的最大值。此外，人肝肿瘤的IER5基因对照射比较敏感，而人肺与脑肿瘤的IER5基因不敏感。结论IER5基因有可能成为宫颈癌与肝肿瘤新的辐射损伤生物分子的一个标记物，对肝肿瘤放疗具有潜在的应用价值。

宫颈癌细胞辐射敏感性与IER5基因的关系

[目的]通过RNA干扰技术致基因沉默和基因过表达的方法研究IER5基因与宫颈癌SiHa细胞系辐射敏感性的相关性,探讨IER5基因不同表达的细胞系对辐射敏感性的差异。[方法]构建IER5沉默及过表达的真核表达载体,转染细胞并筛选出稳定表达的细胞系,经Western Blot和Real-time PCR鉴定成功。观察IER5基因不同表达的3种细胞系的形态;对细胞系进行4Gy的辐射后使用CCK-8检测细胞生长曲线;对细胞系进行10Gy的辐射后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;对细胞系进行4Gy的辐射后使用流式细胞仪检测不同时间点细胞周期的情况。[结果]IER5基因沉默使SiHa细胞略有增大,照射后的细胞增殖速度加快;而其过表达可使SiHa细胞缩小呈圆形,并且细胞增殖速度有所减慢。IER5沉默导致辐射诱导的SiHa细胞凋亡率降低,过表达可促进辐射诱导的SiHa细胞凋亡,其凋亡在照射后48h最为显著。照射后细胞周期的G2-M期阻滞效应随IER5表达含量的降低而升高,IER5基因沉默促进细胞的增殖分裂。[结论 ]IER5基因与宫颈癌SiHa细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化及对辐射的反应有明显相关性,IER5基因可能可提高宫颈癌细胞对放射的敏感性。