IFITM1和Wnt/β-catenin信号通路在结肠癌发生发展中的作用

目的探究干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1)在结肠癌中的表达以及其在结肠癌中发挥的作用。方法应用生物信息学分析IFITM1在结肠癌中的表达情况和预后情况,并分析IFITM1与β-连环蛋白的相关性。免疫组化观察IFITM1和β-catenin在结肠癌及癌旁组织中的表达情况。构建IFITM1过表达细胞模型,CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化,双荧光素酶报告基因检测TCF/LEF转录因子的激活情况,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路上关键蛋白β-catenin、C-myc、CyclinD1的表达情况。结果在线数据库分析结果显示,IFITM1在结肠癌中高表达(P<0.05),且与患者的预后不良显著相关;IFITM1与β-catenin之间存在正相关关系。免疫组化染色结果显示,IFITM1和β-catenin在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织,IFITM1的表达同肿瘤直径大小及组织浸润程度有关(P<0.05),与其他因素无关(P>0.05);β-catenin的表达与仅与肿瘤直径大小有关(P<0.05),与其余因素无关(P>0.05),且二者之间存在正向相关性。在结肠癌细胞HCT-15中过表达IFITM1后,OE-IFITM1组细胞的增殖能力显著高于OE-NC组(P<0.05),OE-NC组和MOCK组之间无差异(P>0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,OE-IFITM1组的启动子活性高于OE-NC组(P<0.05),OE-NC组与MOCK组之间无差异(P>0.05)。Western blot结果显示,OE-IFITM1组的β-catenin,CyclinD1,C-myc的表达量高于OE-NC组(P<0.05),OE-NC组和MOCK组之间蛋白表达无差异(P>0.05)。结论IFITM1在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织,并可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进细胞增殖。

Ifitm1基因在小鼠卵泡发育与排卵过程中的功能及相关调控机制

为深入了解哺乳动物卵泡发育的机制,对小鼠卵巢颗粒细胞中干扰素诱导的跨膜蛋白1(interferon-induced transmembrane protein 1,Ifitm1)基因进行超表达和抑制表达分析,通过流式细胞术、荧光定量PCR、EdU法及western blot分析Ifitm1对小鼠颗粒细胞生长的影响及对小鼠排卵相关基因表达的调控作用,并用相关通路抑制剂处理颗粒细胞,探究Ifitm1影响小鼠卵泡发育及排卵的相关机制。结果显示,在小鼠卵巢颗粒细胞中成功地超表达和抑制表达了Ifitm1基因,干扰Ifitm1基因表达使细胞周期蛋白Ccnd1表达降低了63.5%,G0/G1期细胞占比也下降,使细胞阻滞在G2/M期,从而抑制颗粒细胞增殖;干扰Ifitm1基因还导致排卵标记基因Lhr、Ereg、Cyp19a1表达水平提高了1.95~6.76倍(P<0.05),并抑制PI3K/AKT信号通路上关键蛋白p-AKT(Ser473)的表达,而阻断PI3K/AKT信号通路后再抑制Ifitm1基因表达,Lhr、Ereg和Cyp19a1的mRNA水平则未出现明显改变,说明Ifitm1基因通过抑制PI3K/AKT信号通路活性影响排卵。以上结果表明,Ifitm1基因通过PI3K/AKT通路介导在小鼠颗粒细胞生长以及卵泡排卵过程中发挥重要作用。

IFITM3通过P38-MAPK/EMT信号轴对胃癌细胞的影响

目的 探究IFITM3在胃癌中的表达及其对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 利用数据库分析IFITM3在胃癌中的表达及分析IFITM3与胃癌患者总体生存率的相关性;在胃癌细胞SGC-7901中转染siIFITM3,利用CCK-8实验、流式细胞术和伤口愈合实验分别分析细胞增殖、凋亡及迁移。Western blot检测P38-MAPK磷酸化水平和EMT相关蛋白(E-cadherin、Snail和Vimentin)的表达。结果 IFITM3在胃癌中高表达且与胃癌患者总体生存率负相关;在SGC-7901细胞中转染si-IFITM3能有效敲低IFITM3的表达;敲低IFITM3能显著抑制细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,同时也能减少P38-MAPK的磷酸化和EMT相关蛋白的表达。结论 敲低IFITM3能通过减少P38-MAPK蛋白磷酸化,抑制胃癌细胞EMT,从而减缓细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡。

沉默IFITM1基因对卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨siRNA沉默IFITM1基因表达对卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭的影响。方法利用脂质体转染法将靶向IFITM1的小干扰RNA(siRNA)转染卵巢癌细胞株CP70;qRT-PCR和Western blot观察转染后CP70细胞IFITM1mRNA和蛋白表达的变化;平板克隆形成实验和Transwell小室分别检测各组细胞增殖和侵袭能力的变化。结果转染组CP70细胞的IFITM1mRNA和蛋白表达明显受抑制;转染组、阴性对照组及转染试剂对照组形成克隆数分别为84、181、178,克隆形成率分别为42%、90.5%、89%,迁移出的细胞分别约为59个、121个、126个,转染组结果与其他两组之间有统计学差异,说明转染IFITM1siRNA抑制了卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭能力。结论沉默IFITM1可以降低卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力,IFITM1可能成为卵巢癌治疗的潜在新靶点。

IFITM1基因启动子甲基化与新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的相关性

目的探讨IFITM1基因启动子甲基化与新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的相关性以及早期诊断的可行性,分析IFITM1基因甲基化对mRNA表达的影响。方法采用甲基化特异性PCR方法和HPV16、HPV18特异的PCR方法分别检测了40例正常子宫颈组织和40例新疆维吾尔族妇女子宫颈癌组织的IFITM1基因启动子甲基化情况和高危险性HPV的感染情况,并分析两个指标的相关性。用RT-PCR方法检测10例甲基化阳性和10例甲基化阴性的组织IFITM1基因的mRNA表达情况。结果 31例子宫颈癌组织IFITM1基因启动子甲基化,3例子宫颈正常组织发生甲基化,在子宫颈癌中高危险性HPV的感染例数为27例,在正常组织中为5例。40例子宫颈癌组织中,HPV16、HPV18感染阳性的组织IFITM1基因甲基化的发生率增高(P<0.05),在10例甲基化阳性的组织中IFITM1基因mRNA的表达水平明显低于10例甲基化阴性的组织(P<0.01)。结论 IFITM1基因启动子甲基化是子宫颈癌发生的关键分子标志物,具有大规模临床筛选试验的价值。

IFITM1克隆测序及生物信息学分析

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因（interferon induced transmembrane protein 1．IFITM1）克隆、测序，对序列进行分析，并获取生物学信息。方法以IFITM1的cDNA为模板，用Pfu酶做PCR扩增，在EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，将IF—ITM1的cDNA片段克隆到pUCm—T质粒，对重组的pUCm—T-IFITM1测序后，采用All GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDBSe—quences Database和Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）对IFITM1的eDNA进行生物信息学分析。结果扩增后，含有IFITM1基因eDNA的PCR产物约1000bp，IFITM1的eDNA成功克隆到pUCm—T质粒并进行测序。序列分析结果显示，IFITM1结构cDNA全长683bp，有2个外显子。IFITM1的mRNA编码的氨基酸在37～57和87～107有2个跨膜区，编码125个氨基酸的多肽，其蛋白相对分子质量为14kDa。结论，IFITM1基因的成功扩增、克隆、测序，获取了IFITM1基因的eDNA、mRNA以及编码蛋白质氨基酸的生物学信息，有利于研究IFITM1基因与大肠癌的关系。

IFITM3基因的克隆及其在真核细胞中的表达与定位研究

目的:干扰素rhIFN-α2B体外诱导人胚胎肾细胞系293T细胞获得IFITM3基因,观察IFITM3基因在293T细胞中的表达与定位。方法:利用干扰素rhIFN-α2B体外诱导293T细胞获得IFITM3基因,采用RT-PCR技术扩增获得干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3全长cDNA,扩增产物连接至pMD18-T载体上,测序正确后,将IFITM3基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中获得重组质粒pV-IFITM3,通过转染293T细胞进行表达与定位研究。结果:RT-PCR和Western blot结果表明,获得的目的基因IFITM3能够表达,且具有良好抗原活性;激光共聚焦显微镜观察显示,IFITM3基因表达后主要分布于细胞膜上。结论:成功获得IFITM3基因,并验证了其表达。该研究为基于IFITM3的抗病毒药物以及探讨其抗病毒机制研究奠定了坚实基础。

IFITM3基因表达对胃癌细胞侵袭和转移的影响

目的探讨胃癌组织IFITM3基因表达对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学、Western blot等方法检测120例胃癌患者癌及癌旁组织IFITM3基因表达情况;运用Transwell侵袭实验和划痕实验检测转染shRNA-IFITM3质粒对胃癌细胞株(AGS和MKN45细胞)侵袭和转移能力的影响。同时观察裸鼠体内接种低表达的IFITM3胃癌AGS细胞后发生肺转移情况。结果胃癌组织IFITM3mRNA和蛋白表达水平均显著高于对应癌旁组织(P<0.05);AGS和MKN45细胞中IFITM3mRNA呈高表达。转染shRNA-IFITM3质粒后AGS和MKN45细胞侵袭能力均明显降低(P<0.05),AGS细胞迁移能力显著下降(P<0.05)。裸鼠体内接种低表达的IFITM3胃癌AGS细胞后肺转移率显著下降(P<0.05)。结论 IFITM3基因在胃癌组织呈高表达,IFITM3基因在胃癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用。

DDR2和IFITM1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探讨DDR2和IFITM1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义。方法:选取135例非小细胞肺癌组织和癌旁组织,免疫组织化学法检测组织中DDR2和IFITM1蛋白表达,分析DDR2和IFITM1表达与患者临床病理特征之间关系,Spearman相关分析法分析非小细胞肺癌组织中DDR2和IFITM1表达相关性,Kaplan-Meier法评估DDR2和IFITM1表达与非小细胞肺癌患者生存期的关系,Cox回归模型分析影响患者预后因素。结果:与癌旁组织相比,非小细胞肺癌组织中DDR2和IFITM1蛋白阳性表达率均显著提高(P<0.05),且两者表达具有高度一致性。肿瘤分化程度越低、TNM分期越高及淋巴结转移时DDR2和IFITM1蛋白阳性表达率越高(P<0.05)。DDR2阳性表达患者3年生存率为40.00%,显著低于阴性表达患者63.33%(P<0.05);IFITM1阳性表达者3年生存率36.00%显著低于阴性表达患者54.35%(P<0.05)。DDR2和IFITM1均是影响患者预后的独立因素。结论:非小细胞肺癌组织中DDR2和IFITM1均异常表达,两者参与该疾病的发展过程,与患者预后不良相关,对预后评估有一定参考价值。

siRNA沉默IFITM1对卵巢癌细胞系CP70生物学效应的影响及机制研究

目的:采用siRNA技术沉默IFITM1基因表达,观察对卵巢癌CP70细胞侵袭及凋亡能力的影响及其可能的分子机制。方法:利用脂质体转染法将靶向IFITM1的小干扰RNA转染卵巢癌CP70细胞株;Westernblot检测CP70细胞IFITM1蛋白的表达;Transwell侵袭小室、MTT、流式细胞仪检测转染细胞侵袭力、顺铂敏感性和凋亡的变化;Western blot观察转染后CP70细胞caspase-3的表达变化。结果:转染IFITM1siRNA后卵巢癌CP70细胞的IFITM1表达受到高效而特异的抑制,减低了卵巢癌细胞的侵袭力,增加了细胞对顺铂的敏感性,促进了细胞凋亡,蛋白印迹结果显示转染细胞在顺铂作用下caspase-3磷酸化水平明显上调。结论:沉默IFITM1可以降低卵巢癌细胞的侵袭能力,提高对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡可能与上调凋亡相关的关键分子密切相关,IFITM1可能成为卵巢癌治疗的潜在靶点之一。

维吾尔族妇女子宫颈癌组织中IFITM1、Ki-67和PCNA的表达

目的探讨维吾尔族妇女子宫颈癌组织中IFITM1、PCNA和Ki-67蛋白的表达。方法采用免疫组化SP法检测IFITM1、PCNA和Ki-67蛋白在维吾尔族妇女子宫颈癌和慢性子宫颈炎组织中的表达。结果 IFITM1蛋白在子宫颈鳞癌组织中的表达低于慢性子宫颈炎组织,差异有统计学意义(P=0.003);子宫颈癌组织中Ki-67和PCNA蛋白表达高于慢性子宫颈炎组织,差异有统计学意义(P=0.019,P=0.000)。结论 IFITM1蛋白在子宫颈癌组织中的表达降低,Ki-67和PCNA蛋白在子宫颈癌组织中的表达水平增高,可能与维吾尔族妇女子宫颈癌的发生有关。

IFITM2的克隆表达及其抗病毒作用初探

目的:构建含有ifitm2基因的重组质粒,在人胚肾HEK293T细胞中表达,并验证IFITM2蛋白的抗病毒作用。方法:参照Genbank ifitm2基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR技术扩增ifitm2基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-sim-ple载体上,目的基因测序正确后进一步亚克隆至真核表达载体pVAX1上,转染HEK293T细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)和激光共聚集显微镜(LCSM)验证外源基因在细胞内的表达情况。同时HEK293T细胞过表达IFITM2蛋白,利用含有EGFP基因的VSV-G假膜病毒感染细胞,通过Western blot检测IFITM2蛋白对病毒的抑制作用。结果:成功获得ifitm2基因,测序正确,将其连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,证明含有ifitm2基因的重组质粒构建成功,Western blot和LCSM分析表明,目的基因能够在HEK293T细胞中表达,且呈广泛分布。过表达IFITM2蛋白后,荧光蛋白分析表明,该蛋白对病毒感染具有一定的抑制作用。结论:成功构建了含有ifitm2基因的重组真核表达质粒,该质粒可以在真核细胞中得到有效表达,且对VSV-G假膜病毒具有一定抑制作用,该研究为进一步探讨IFITM2蛋白的抗病毒作用及其分子机制提供了实验及理论基础。

鸡IFITM3基因编码区克隆及生物信息学分析

为探究鸡IFITM(Interferon-Induced Transmembrane,IFITM)3基因SNPs(Single Nucleotide Polym orphisms,SNPs)位点的多态性,挖掘其潜在的功能性位点,本研究对鸡IFITM3基因编码区进行克隆,结合多种生物信息学方法对蛋白nsSNPs(nonsense-SNPs, nsSNPs)位点及基因的选择压力进行综合分析。结果显示:本研究克隆了IFITM3基因编码区,为414 bp,共编码137个氨基酸;该蛋白质为稳定的、非分泌型、疏水性小分子跨膜蛋白,并具有磷酸化、糖基化、棕榈酰化修饰位点。本研究发现5个SNP,其中SNP1在测序鸡种中已经固定,不具有多态性;其余4个SNP的多态性在测序鸡种的群体中存在差异,且都属于中性位点。分析发现:鸡IFITM3基因存在2个nsSNPs位点,其中V103I突变对蛋白的影响程度低,是非保守性的中性位点。H126P突变可能改变位点的氢键数目降低蛋白的分子间作用力,影响蛋白空间结构的稳定性。IFITM3编码区序列十分保守,在禽类的选择压力分析中,只检测到120V位点。综上所述,H126P位点可作为优良鸡种免疫分子选育的潜在功能性位点。

IFITM蛋白研究进展

干扰素诱导的横跨膜蛋白(IFITM)是一种近来发现的细胞内抗病毒蛋白家族,它能抑制多种有或者无包膜的病毒的复制。IFITM蛋白定位于细胞膜和内涵体膜,是许多病毒入侵的通道。生化和膜融合研究显示IFITM蛋白可能通过调控细胞膜的流动性抑制病毒入侵。本文对IFITM蛋白近期的研究进展及未来的研究方向作一综述。

IFITM和IFIT家族基因的抗病毒机制研究进展

干扰素诱导的跨膜(Interferon-induced transmembrane,IFITM)蛋白家族和干扰素诱导(Interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats,IFIT)蛋白家族作为受干扰素所诱导的,执行抗病功能的家族,在免疫反应中扮演着至关重要的角色;特别是IFIT5是家禽体内存在唯一的IFIT家族成员。IFITM通过抑制病毒包膜与宿主细胞膜的融合,从而抑制病毒的入侵;而IFIT则是抑制病毒的转录与复制,阻断病毒繁殖,从而抑制病毒的感染。两者在生物体内协同发挥抗病毒功能,清除病毒,保护宿主细胞正常的生理活动。在数万年的进化中,病毒也进化出相应的机制来逃避免疫蛋白的抑制。文章就IFITM和IFIT基因家族抗病毒机制的研究进展进行总结,为之后的研究提供参考。

IFITM5在不同癌细胞系中的差异表达

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白5(IFITM5)在人骨肉瘤15种细胞系中的表达。方法应用RT-QPCR和Western blot检测IFITM5在SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD等癌细胞系中m RNA和蛋白表达差异。结果在H7402、RD、HEP2细胞系中IFITM5 m RNA和蛋白的表达水平最低,其他细胞系次之,在SAOS2和3A0细胞系中两者均呈高表达。结论 IFITM5在癌细胞系中存在并有表达差异,为后续研究IFITM5在肿瘤中的作用奠定基础。

IFITM1基因克隆及其在不同生长阶段牦牛各组织中的表达分析

为鉴定牦牛IFITM1基因并分析其在不同生长阶段牦牛5种组织中的转录水平和蛋白表达量。本研究采用根据普通牛IFITM1基因设计的引物,PCR扩增牦牛IFITM1基因并利用生物信息学软件分析其序列,结果显示,获得牦牛546 bp的IFITM1基因cDNA序列,其中编码(CDS)区为375 bp,编码124个氨基酸残基。牦牛IFITM1基因序列与普通牛的同源性最高,为98.7%。进一步采用荧光定量PCR检测IFITM1基因在不同生长阶段牦牛各组织中的转录水平,结果显示,IFITM1在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均有不同程度的转录水平,在肝脏中的转录水平均显著高于在脾脏、肺脏和肾脏中的转录水平(p<0.05),随着年龄的增长IFITM基因在牦牛肝脏中的转录水平呈现先上升后下降的趋势,15月龄相对于1日龄时的转录水平显著升高(p<0.01),随着年龄的增长IFITM1基因的转录水平在耗牛肺脏中呈现持续下降的趋势,而在脾脏和肾脏中呈现先下降后稳定的趋势,且5岁龄相对于1日龄时的转录水平均显著降低(p<0.01)。同时采用免疫组化技术检测IFITM1蛋白在牦牛肝脏中的定位及表达。结果显示,IFITM1蛋白在3个生长阶段牦牛的肝脏中均有表达并定位于细胞膜,且该蛋白表达量随着年龄的增长呈现先下降后上升的趋势。本研究为深入探究IFITM1蛋白的功能奠定基础。

白来航鸡IFITM1基因表达规律分析及其对鸡内源性反转录病毒转录的影响

IFITMs在天然免疫中发挥重要作用,抑制多种病毒复制。试验取5和30日龄白来航鸡心、肝、脾、胸腺和法氏囊,RT-qPCR检测其IFITM1基因的表达差异;用0.5μmol·L^-1 DNA甲基化酶抑制剂DAC处理鸡成纤维细胞CEF和鸡巨噬细胞HD11,RT-qPCR检测处理后IFITM1的表达水平;PCR扩增IFITM1基因CDS区克隆、测序,进而构建pcDNA3.1-IFITM1真核表达载体;将过表达载体转染至CEF和HD11细胞,RT-qPCR检测IFITM1过表达对鸡内源性反转录病毒ALVE1、OVEX1和EAV-HP转录的影响。结果表明:IFITM1基因在胸腺、法氏囊等免疫器官中的表达量高于心、肝和脾等非免疫器官,且随着日龄的增长,在胸腺中的表达量上升,而在法氏囊中的表达量下降;DAC处理后,IFITM1表达极显著上调;测序发现IFITM1基因CDS区大小为342bp;IFITM1过表达后,ALVE1、OVEX1在CEF和HD11细胞中转录均极显著下调,EAV-HP只在CEF细胞中极显著下调,而在HD11细胞中无显著变化。这一研究初步分析了鸡IFITM1基因的表达规律,构建了其真核表达载体,检测了其对鸡内源性反转录病毒转录的影响,为进一步研究其功能奠定了基础。

鸡IFITM/IFIT基因家族中与抗禽流感病毒相关的关键基因挖掘

为深入了解分析鸡IFITM/IFIT基因家族的特性,以禽流感病毒攻毒后的鸡RNA-seq数据为研究对象,通过加权基因共表达网络分析,构建了鸡的肺组织对不同亚型禽流感免疫反应的加权基因共表达网络,并对其模块进行了性状关联性分析与功能富集分析,进而筛选出鸡IFITM/IFIT基因家族中与抗禽流感病毒胁迫相关的枢纽基因。结果显示:鸡IFITM/IFIT基因家族成员中,IFITM2,IFITM3和IFIT5基因参与应答禽流感病毒诱发的免疫反应。其中,IFIT5基因属于H5N1病毒早期免疫应答模块的枢纽基因,在H5N1病毒诱发的早期免疫通路中发挥重要作用。

奶牛早期妊娠阶段外周血中IFITM1和RSAD2基因的表达

为研究干扰素刺激基因IFITM1和RSAD2在奶牛早期妊娠阶段外周血中的表达规律,于人工授精后0、14、18、21和28d采集奶牛外周血,利用荧光定量PCR检测IFITM1和RSAD2的相对表达量,采用化学发光法同步检测血清中孕酮浓度;并深入分析自然发情和同期发情2种状态下青年母牛外周血中RSAD2基因的相对表达及其在18d和21d外周血白细胞亚类(淋巴细胞、NK细胞、单核细胞)中的相对表达。结果表明,妊娠牛与空怀牛血清孕酮在21d和28d呈显著差异。人工授精后14d和18dIFITM1基因在妊娠牛与空怀牛中都显著下调,但在空怀牛与妊娠牛间差异不显著。妊娠牛外周血中RSAD2于21d显著上调;18d时,RSAD2在妊娠青年牛外周血中的表达量显著高于空怀牛。进一步分析结果表明:自然发情条件下,妊娠牛外周血中RSAD2表达量显著高于空怀牛,同期发情条件下该基因在趋势上与之类似但统计学上不显著。人工授精后18d和21d,RSAD2在妊娠牛与空怀牛外周血淋巴细胞、NK细胞和单核细胞中的表达均无显著差异。研究提示:IFITM1不适合用于奶牛早期妊娠诊断;利用RSAD2的相对表达量可望对青年牛在18d做出早期诊断,具体判别标准有待于进一步扩群分析。