IFITM2的克隆表达及其抗病毒作用初探

目的:构建含有ifitm2基因的重组质粒,在人胚肾HEK293T细胞中表达,并验证IFITM2蛋白的抗病毒作用。方法:参照Genbank ifitm2基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR技术扩增ifitm2基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-sim-ple载体上,目的基因测序正确后进一步亚克隆至真核表达载体pVAX1上,转染HEK293T细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)和激光共聚集显微镜(LCSM)验证外源基因在细胞内的表达情况。同时HEK293T细胞过表达IFITM2蛋白,利用含有EGFP基因的VSV-G假膜病毒感染细胞,通过Western blot检测IFITM2蛋白对病毒的抑制作用。结果:成功获得ifitm2基因,测序正确,将其连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,证明含有ifitm2基因的重组质粒构建成功,Western blot和LCSM分析表明,目的基因能够在HEK293T细胞中表达,且呈广泛分布。过表达IFITM2蛋白后,荧光蛋白分析表明,该蛋白对病毒感染具有一定的抑制作用。结论:成功构建了含有ifitm2基因的重组真核表达质粒,该质粒可以在真核细胞中得到有效表达,且对VSV-G假膜病毒具有一定抑制作用,该研究为进一步探讨IFITM2蛋白的抗病毒作用及其分子机制提供了实验及理论基础。

日本脑炎病毒sfRNA靶向PKR和IFITM2的翻译抑制细胞干扰素应答

本研究旨在探究日本脑炎病毒(JEV)感染细胞后产生非编码亚基因组RNA(sfRNA)的生物学功能。应用Northern blot检测JEV感染细胞产生sfRNA的动态特征;通过Western blot和qPCR检测JEV感染细胞中PKR、IFITM2等干扰素刺激基因的表达;通过体外转录制备JEV sfRNA,转染细胞研究其功能。实验结果表明:JEV感染Huh7细胞后期可下调PKR、IFITM2的表达,与sfRNA产生的时间规律一致;将体外转录制备的JEV sfRNA转染细胞后可下调IFN-α刺激细胞中IFITM2、PKR蛋白的含量,但其mRNA水平与对照组差异不显著,推测JEV sfRNA抑制其翻译过程;SL-Ⅱ区域缺失的JEV sfRNA不能有效下调干扰素诱导细胞中IFITM2和PKR蛋白的表达。因此,本研究发现JEV sfRNA在翻译阶段抑制PKR和IFITM2蛋白的表达,为病毒增殖营造有利环境。

IFITM2在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨干扰素诱导跨膜蛋白2(IFITM2)在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。方法收集南方医科大学顺德医院2012年1月至2015年1月收治的54例胃癌患者癌组织及对应的癌旁组织样本,检测胃癌与癌旁组织、胃癌细胞MKN45与正常胃黏膜上皮细胞GES-1中IFITM2的表达水平,分析胃癌组织中IFITM2的表达与临床病理特征及预后的关系。沉默IFITM2表达,检测MKN45细胞的迁移和侵袭能力,及对E-cadherin和Vimentin表达水平的影响。结果胃癌组织及MKN45细胞中IFITM2的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.01),胃癌组织中IFITM2的表达水平与TNM分期、肿瘤浸润程度、淋巴结及远处转移情况相关(P<0.05),并与患者的预后不良相关(P<0.05)。沉默IFITM2后,MKN45细胞的迁移和侵袭能力降低(P<0.05),并能上调E-cadherin的表达和抑制Vimentin的表达(P<0.05)。结论IFITM2在胃癌组织和细胞中高表达,通过调控E-cadherin和Vimentin的表达而促进胃癌细胞的迁移和侵袭,并与患者的预后不良显著相关。

干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM1／2／3对SFTS病毒感染的影响

目的 在细胞水平初步探索IFITM1／2／3对SFTS病毒感染的影响。方法分别构建IFITM1／2／3真核表达载体并验证其在细胞内的表达。在过表达IFITM1／2／3的Vero和THP—1细胞中，利用实时荧光定量PCR检测不同时间点SFTS病毒的复制情况。结果间接免疫荧光及WesternBlot检测显示重组IFITM1／2／3表达质粒在Vero细胞及THP-1细胞内可表达。实时荧光定量PCR结果显示，IFITM1／2／3对SFTS病毒在细胞内的感染均具有显著的抑制作用，尤其是在细胞感染早期，过表达的IFITM1／2／3对低剂量SFTS病毒感染的抑制作用更为明显。结论IFITM1／2／3可在细胞水平抑制病毒复制。

干扰素诱导跨膜蛋白2对脑心肌炎病毒体外增殖的影响

目的探讨干扰素诱导跨膜蛋白2(interferon induced transmembrane proteins 2,IFITM2)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)体外增殖的影响。方法将重组表达质粒pcDNA3.1-IFITM2及靶向IFITM2的siRNA序列分别转染HEK293细胞,qPCR法和Western blot法检测IFITM2基因,mRNA的转录水平及蛋白表达水平。将EMCV按100 TCID50感染HEK293细胞,检测病毒拷贝数及病毒滴度,评价过表达及抑制表达IFITM2对EMCV增殖的影响。将EMCV按MOI=3感染过表达IFITM2的HEK293细胞,检测病毒拷贝数,评价IFITM2过表达对EMCV吸附及进入的影响。结果转染重组表达质粒后,HEK293细胞中IFITM2基因mRNA转录水平及蛋白表达水平均明显升高(P<0.001);转染siRNA序列后,两者均明显降低(P<0.001)。过表达IFITM2的HEK293细胞中的病毒拷贝数及病毒滴度明显降低(P<0.05),抑制IFITM2表达的HEK293细胞中的病毒拷贝数及病毒滴度明显升高(P<0.001)。过表达IFITM2的HEK293细胞的吸附病毒粒子数变化差异无统计学意义(P>0.05),进入病毒粒子数明显降低(P<0.01)。结论 IFITM2可抑制EMCV在HEK293细胞中的增殖,主要在病毒复制早期发挥作用。