IFITM3真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的真核表达载体并观察其表达产物的细胞内定位,以研究IFITM3的蛋白功能及作用机制。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,行RT-PCR扩增IFITM3编码序列并经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小,PCR产物及真核表达载体pEGFP-C2经酶切、连接、转化入Top10菌株进行筛选和扩增,重组的pEGFP-C2-IFITM3载体用酶切及DNA测序鉴定其插入序列的正确性,进而转染该重组真核表达载体进入sy5y细胞,倒置荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内定位。结果琼脂糖凝胶电泳显示经RT-PCR的扩增产物与IFITM3编码区的实际长度相吻合,重组入绿色荧光载体pEGFP-C2的pEGFP-C2-IFITM3经酶切和测序显示实际连入的DNA片段大小、序列及读码框均正确。经真核表达后,重组蛋白定位于细胞膜和在细胞内存在颗粒样聚集。结论成功构建IFITM3的真核表达载体,该载体表达的IFITM3融合蛋白在细胞内定位清晰,为后续的IFITM3功能研究奠定了基础。

包虫囊液对干扰素信号TRIF/IFITM3通路的影响

目的 探索包虫囊液干预人源肝细胞(L02)过程中TRIF/IFITM3通路相关蛋白的变化。方法 从感染细粒棘球蚴病的羊肝中获取囊液,用不同比例囊液浓度(1∶10、1∶100和1∶1000)干预肝细胞并设置阴性对照组(未加囊液干预)。采用囊液浓度(1∶1000)干预肝细胞后分别在0、24、48和72 h收集细胞。实时荧光定量PCR检测TRIF/IFITM3通路相关mRNA的表达,Western blot检测TRIF、IRF3、IFITM3、Foxp3的蛋白表达变化。免疫荧光检测IFITM3、Foxp3的表达和定位。Spearman分析TRIF、IFITM3及Foxp3的相关性。结果 Western blot显示囊液浓度(1∶1000)促进TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达,TRIF的相对表达量分别是(0.45±0.09)、(0.54±0.05)、(1.08±0.24)、(1.75±0.31);IFITM3的相对表达量分别是(1.02±0.41)、(1.00±0.16)、(1.24±0.12)、(1.84±0.20)。囊液浓度(1∶1000)刺激肝细胞0、24、48和72 h后,Western blot显示TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达量逐渐下降,而Foxp3表达量增高。TRIF的相对表达量分别是(1.00±0.31)、(1.08±0.19)、(0.90±0.13)、(0.57±0.05);IFITM3的相对表达量分别是(0.80±0.26)、(0.94±0.09)、(0.82±0.19)、(0.54±0.18)。Foxp3的相对表达量分别是(0.70±0.11)、(0.80±0.02)、(0.83±0.03)、(1.08±0.04)。免疫荧光显示,在泡球蚴感染60 d时,小鼠肝脏IFITM3和Foxp3发生共定位。Spearman分析TRIF与IFITM3存在正相关性(r=0.704,P<0.01),TRIF与Foxp3存在负相关性(r=-0.859,P<0.01),IFITM3与Foxp3存在负相关性(r=-0.686,P<0.01)。结论 较低浓度的包虫囊液刺激TRIF/IFITM3通路相关分子表达,进而激活天然免疫的抗病原体功能;随着囊液干预时间增加TRIF/IFITM3受抑制,而Foxp3高表达,促进包虫在宿主体内慢性寄生。

甲型流感病毒感染野生型和Ifitm3^-/^-小鼠的纵膈淋巴结的转录组学研究

干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)敲除小鼠(Ifitm3^-/^-小鼠)感染流感病毒后,表现出更为严重的病理损伤和死亡率。最近的研究发现,IFITM3蛋白表达也会影响机体针对流感病毒的适应性免疫反应效果。由于空间效应,纵膈淋巴结在机体抵抗流感病毒急性期感染的适应性免疫应答过程中发挥重要功能,本研究欲探究使用流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/H1N1进行感染后,野生型和Ifitm3^-/^-小鼠的纵膈淋巴结中与免疫相关的差异表达基因。本研究对流感病毒PR8感染后第3d的纵膈淋巴结进行RNA-Seq测序。高通量测序共检测到有1312个差异表达基因,其中上调和下调差异表达基因分别为904和408个。这些差异表达基因主要参与炎症反应与细胞凋亡信号通路、T细胞和B细胞受体信号通路、T细胞和B细胞激活与细胞因子分泌等信号通路。采用荧光定量PCR对部分免疫相关的差异表达基因进行验证,结果与RNA-Seq测序结果一致。本研究为进一步阐明IFITM3在适应性免疫应答中拮抗流感病毒的分子机制奠定了基础。

干扰素诱导的跨膜蛋白在肿瘤中的研究进展

干扰素诱导的跨膜蛋白（IFITM）是一种近来发现的细胞内抗病毒蛋白家族,它能抑制多种有或者无胞膜病毒的复制而起到抗病毒作用;同时近期有研究显示IFITM3对人类多种肿瘤细胞及干细胞的迁移等起重要作用,但IFITM3在人类肿瘤发生、发展和扩散转移的作用机制尚不明确.本文主要对IFITM3蛋白在人类肿瘤的研究进展及未来的研究方向作一综述.

干扰素诱导跨膜蛋白3对流感疫苗免疫反应的影响

干扰素诱导跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)的单核苷酸突变位点(Singlenucleotide polymorphism,SNP)rs12252-C在中国人群的比例高,与流感病毒H1N1/09感染后疾病的严重性相关。本文主要探索流感病毒三价灭活疫苗(Trivalent inactivated vaccine,TIV)免疫IFITM3敲除小鼠后机体免疫反应的变化。采用转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术构建IFITM3敲除小鼠模型,TIV肌肉注射免疫小鼠,使用流式细胞术检测小鼠脾脏的获得性免疫细胞,如T细胞、B细胞,以及固有免疫细胞,如自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK细胞)、树突状细胞(Dendritic cell,DC)、巨噬细胞(Macrophage,Mф)、中性粒细胞等的数量变化情况。TIV免疫后7d,IFIMT3敲除小鼠脾脏CD8^+T细胞、NK细胞的数量和活化水平升高,生发中心(Germinal center,GC)的B细胞数量下降,CD4^+T细胞、DC、Mф、中性粒细胞的数量没有显著变化。本研究提示,IFITM3敲除影响了TIV免疫后小鼠脾脏免疫细胞的数量和活化水平,为IFITM3与免疫反应的关系研究奠定了基础。