FMDV 3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用

本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测3D蛋白在细胞内的表达及定位。通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50等试验检测HEK-293T细胞中过表达3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响。结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制。本研究为深入探究3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础。

IFNα-2b治疗323例HBeAg阳性慢性乙型肝炎的效果

目的 探讨IFNα-2b抗病毒治疗乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者的效果。方法回顾性分析2010年1月至2014年1月就诊于南昌大学第二附属医院并接受IFNα-2b治疗的323例HBeAg阳性CHB患者的临床资料,按丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平将其分为3组:ALT<2×ULN(A1组,n=111)、2×ULN≤ALT≤5×ULN(A2组,n=111)以及ALT>5×ULN(A3组,n=101)。观察临床疗效及不良反应,并比较3组间的抗病毒效果。结果 在停药时及停药后第12、24、48、72、96、144、192、240周,323例患者的HBV-DNA阴转率分别为39.9%、40.2%、39.0%、36.2%、34.1%、33.4%、31.3%、30.7%、30.7%;HBsAg阴转率分别为6.2%、6.2%、6.2%、5.9%、5.9%、5.9%、5.6%、5.6%、5.6%;HBeAg血清学转换率分别为28.2%、31.0%、32.8%、34.4%、33.7%、33.1%、32.8%、32.5%、31.6%。在各随访时间点,3组患者的HBV-DNA阴转率和HBeAg血清学转换率比较,A3组显著高于A2组,A2组显著高于A1组(P<0.05);3组患者的HBsAg阴转率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。323例患者均出现发热及类流感样症状,238例(73.7%)出现白细胞及中性粒细胞降低,35例(10.8%)甲状腺功能异常,5例(1.5%)斑秃,1例(0.3%)睡眠障碍,经过密切观察和对症处理后,患者均顺利完成疗程,各指标均基本正常。结论 IFNα-2b治疗HBeAg阳性CHB患者在停药时及停药后随访期间均表现出较好的效果,大多数患者可耐受IFNα-2b的不良反应。IFNα-2b的抗病毒效果可能与ALT水平有关。

化疗联合免疫治疗局部晚期食管癌疗效及对Sil⁃2R、IFN⁃γ、TSGF水平的影响

目的研究化疗联合免疫治疗局部晚期食管癌(LAEC)疗效及对可溶性白细胞介素⁃2受体(Sil⁃2R)、γ⁃干扰素(IFN⁃γ)及恶性肿瘤特异生长因子(TSGF)水平的影响。方法选择2021年3月至2023年7月于中国科学院合肥肿瘤医院治疗的LAEC患者106例,依据随机数字表法将106例患者分为试验组(n=53)、对照组(n=53)。对照组行标准化疗,试验组行化疗联合免疫治疗。观察两组临床疗效、不良反应,比较两组治疗前后血清程序性死亡配体1(PD⁃L1)、程序性死亡受体1(PD⁃1)、Sil⁃2R、IFN⁃γ、TSGF水平。结果试验组客观缓解率(ORR)、疾病控制率(DCR)均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组治疗期间各不良反应分级比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,试验组血清PD⁃L1、PD⁃1及Sil⁃2R、TSGF水平均低于对照组,血清IFN⁃γ水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论化疗联合免疫治疗可有效降低LAEC患者免疫检查点活性,增强机体免疫,可促进产生IFN⁃γ,抑制Sil⁃2R、TSGF生成,疗效较好,且不增加不良反应,具有一定的临床应用价值。

奶牛乳房炎相关IFNE基因的克隆、表达及功能研究

【目的】研究干扰素ε(Interferon epsilon,IFNE)基因在奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,bMECs)炎症中的表达模式及其潜在的分子功能。【方法】通过PCR和测序技术得到IFNE基因的编码区(Coding sequence,CDS)序列,并采用生物信息学方法分析IFNE基因及其蛋白质特性;利用RNAi和qPCR技术检测IFNE、干扰素β(Interferon beta,IFNB)、干扰素κ(Inter⁃feronκ,IFNK)、半胱天冬酶3(Cystathione aspartase 3,CASP3)、半胱天冬酶9(Cystathione aspartase 9,CASP9)等基因在脂多糖(Li⁃popolysaccharide,LPS)诱导bMECs炎症反应中的表达量。【结果】IFNE基因的CDS长度为582 bp,可编码由193个氨基酸组成的具有亲水性且不稳定的非分泌蛋白。与对照组(0 h)相比,在LPS诱导3、6、12和24 h的bMECs中白细胞介素⁃6(Interleukin⁃6,IL⁃6)和白细胞介素⁃1β(Interleukin⁃1β,IL⁃1β)的表达量均显著上调(P<0.05,下同),白细胞介素⁃8(Interleukin⁃8,IL⁃8)的表达量极显著上调(P<0.01,下同),表明成功构建了炎症细胞模型。在炎症细胞模型构建成功的基础上,采用qPCR检测bMECs内IFNE基因的表达量结果表明,与对照组(0 h)相比,IFNE基因在LPS诱导bMECs 3、6、12和24 h的表达量均极显著上调,且在诱导6 h的表达量最高。RNAi实验结果表明,干扰IFNE可使得炎症性bMECs内的IL⁃8、IFNB、IFNK和白细胞介素⁃10受体亚基β(Interleu⁃kin⁃10 receptor subunitβ,IL⁃10RB)基因的表达量均显著上调,IL⁃6、IL⁃1β、CASP3、CASP9和BAD基因的表达量均呈极显著上调。【结论】IFNE基因在LPS诱导的bMECs炎症反应中的表达量极显著上调,干扰IFNE基因可通过调控IL⁃6、IL⁃8、IL⁃1β、IFNB、IF⁃NK、CASP3和CASP9等基因的表达而缓解bMECs炎症反应,为奶牛乳房炎的分子治疗和抗乳房炎分子育种奠定理论基础。

PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的疗效及对HBeAg转阴率、免疫功能的影响

目的:分析聚乙二醇干扰素α-2b(PEG-IFNα-2b)联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的效果及对HBeAg转阴率、免疫功能的影响。方法:选取某院2019年3月—2022年3月收治的慢性乙型肝炎患者88例作为研究对象,依据随机抽签法分成研究组与对照组,每组44例。对照组接受替诺福韦治疗,研究组接受PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗,比较2组HBeAg转阴率、HBsAg转阴率、治疗前后肝功能指标[谷氨酰转肽酶(GGT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)]、免疫功能指标(CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、C3、C4)及血清炎性因子[视黄酸受体相关孤核受体(RORγt)、白细胞介素-17(IL-17)、IL-4]水平。结果:研究组HBeAg转阴率、HBsAg转阴率分别为45.45%、13.64%,高于对照组的11.36%、0,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,研究组GGT、AST、ALT、IL-4、IL-17、RORγt分别为(30.42±5.39)U/L、(31.08±6.64)U/L、(29.37±4.68)U/L、(1.32±0.42)pg/mL、(0.64±0.19)pg/mL、(0.80±0.30),均低于对照组的(56.93±8.75)U/L、(38.72±5.83)U/L、(49.61±6.42)U/L、(3.91±1.14)pg/ml、(3.01±0.87)pg/ml、(1.61±0.36),差异有统计学意义(P<0.05)。研究组CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、C3、C4分别为(66.81±8.55)%、(1.53±0.16)、(1.22±0.01)g/L、(0.42±0.07)g/L,均高于对照组的(61.03±8.49)%、(1.26±0.2)、(0.73±0.09)g/L、(0.22±0.06)g/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎效果明显,可提高HBeAg、HBsAg转阴率,改善肝功能,增强免疫功能,抑制炎性反应。

IFN-α/β信号传导研究进展

IFN-α/β是由病毒感染细胞产生并具有多种生物学活性的细胞因子。IFN-α/β通过与细胞表面的特异性受体IFNAR结合,在其效应细胞中诱导多条信号途径发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。近来研究表明,除了经典的JAK-STAT途径外,IFN-α/β还能诱导p38 MAPK、IRS和CrkL等信号传导途径,介导不同的生物学效应。

鸡IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上鸡α-、β-、γ-干扰素（ChIFNα-、β-、γ-）基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以鸡3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因为内参，采用SYBRGreen工染料以建立实时荧光定量PCR检测方法。将IFNα-、β-、γ-基因克隆至pGEM-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，鸡IFNα-、β-、γ-和GAPDH基因的C1值与标准品稀释度在1×10^2～1×10^8 copies／μL范围分别呈良好的线性关系，r^2均大于0．990。熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4h。建立的鸡IFNα-、β-、γ-基N实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在mRNA水平对鸡IFN的定量分析奠定了基础。

当归多糖组分AP-3诱生小鼠脾细胞IL-2和IFN-γ的作用

目的研究当归多糖组分AP-3对细胞因子IL-2和IFN—γ的诱生作用，以探讨其免疫调节的特点。方法流式细胞术测定培养的脾细胞中Cd4^＋细胞比例；酶联免疫法测定培养上清液中IL-2和IFN-γ的浓度；RT—PCR法测定IL-2和IFN-γ mRNA的转录水平。结果AP-3在0．6～2μmol·L^-1，能显著提高培养脾细胞CD^4＋细胞的百分率；在2～6μmol·L^-1，AP-3时间、剂量依赖性地增加培养的细胞上清液中IL-2的浓度和细胞内IL-2 mRNA的转录水平，而对于IFN-γ和IFN-7 mRNA，则先升高后降低，并呈现剂量依赖性。结论当归多糖能够促进IL-2和IFN-γ的分泌，激活Th1细胞，从而发挥免疫调节作用。

惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析

根据红色原鸡IFN A基因设计了引物对 ,采用PCR法克隆并测序了我国地方标准品种惠阳胡须鸡的IFN α基因 ,定名为HyIFNA4。HyIFNA4与红色原鸡类IFN α比较 ,ORF长度均为 582个核苷酸、编码 162个氨基酸 ,相互间同源性在 97 4 %～ 99%。

IFNγ 防治大鼠胆总管结扎所致肝纤维化的实验研究

目的：了解ＩＦＮγ对持续肝外性淤胆所致肝纤维化的作用。方法：制作大鼠持续肝外性淤胆模型，用药组于胆管结扎同时每日肌注ＩＦＮγ５×１０４Ｕ，用药２周；对照组则仅行胆管结扎而不用药。２周后分别测定血清生化指标、肝纤维化指标及肝能量代谢有关指标。结果：ＩＦＮγ可改善血清生化指标（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。在组织学表现上，用药组肝纤维化程度显著低于单纯结扎组（Ｐ＜０．０１）。用药组大鼠淤胆后肝羟脯氨酸及血清透明质酸水平升高明显受抑（Ｐ＜０．０１）。肝ＡＴＰ及ＣＰ测定显示淤胆合并用药时两者均保持于较高水平。

细菌内毒素对鸡NLRC5受体及IFN基因转录的影响

本研究旨在探讨鸡NLRC5受体及IFN基因对不同细菌内毒素的诱导表达变化,为禽类NLRC5受体的分子功能及其参与先天免疫调控的作用机制提供理论依据。用不同浓度的(0、0.1、1.0、10.0μg.mL-1)来自致病性大肠杆菌(E.coli,EC)和肠炎沙门氏菌(S.enteriditis,SE)的2种内毒素(LPS)分别刺激鸡天然巨噬细胞系(HD11)2、4和6h,在不同的时间点收集细胞,提取总RNA,并设计相关引物,利用荧光定量PCR分析鸡NLRC5受体以及下游功能基因IFNA和IFNB的转录量变化,探讨HD11细胞对不同来源的细菌内毒素的免疫反应。研究表明:与对照组相比,1.0和10.0μg.mL-1的EC-LPS、SE-LPS均能诱导HD11细胞产生免疫应答,但0.1μg.mL-1组未能诱导成功;不同细菌LPS诱导的免疫应答时间不一致,经EC-LPS诱导的NLRC5和IFNB基因均在刺激后6h达到转录高峰,与2、4h差异显著(P<0.05),与对照组差异极显著(P<0.01);但IFNA基因在2、6h达到高峰,而在4h下降,呈"V"型转录趋势。SE-LPS诱导的NLRC5和IFNA、IFNB转录量随时间均保持一直上升的趋势,在6h达到高峰,且与对照组及2、4h差异显著(P<0.05)。结果表明NLRC5受体与IFNA和IFNB共同参与了细胞对细菌内毒素的免疫应答,NLRC5基因可能对鸡先天免疫功能具有调节作用。

猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

巴斯德毕赤酵母载体质粒 pPICZαA含有强启动子 PAOXⅠ和α MF信号肽序列,构建猪 IFNα基因的重组质粒pPICZαA IFNα,并转入E .coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪 IFNα基因。通过电击将经 SacⅠ酶切后线性化的 pPICZαA IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母 KM71中。SDS PAGE和Western blot鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的猪 IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原 抗体反应,表达量为 0.45 mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.1×104 IU/mL。

IFN-α2b对慢性乙肝患者抗病毒及免疫调节作用

目的探讨IFN-α2b对慢性乙肝患者抗病毒效果及对CD25的免疫调节作用。方法选择160例慢性乙肝患者(轻度93例,中度67例),随机分为IFN和常规治疗组,用生物素-链霉亲和素(BSA)法和Real-time PCR法分别动态检测PHA诱导前后CD25和CD25 mRNA的表达水平,PCR法动态检测患者治疗前后HBV-DNA水平。结果轻、中度组患者经干扰素治疗后,静息态和诱导态CD25表达水平逐渐升高,其CD25 mRNA含量亦升高。第3疗程后,轻、中度组中以干扰素治疗者CD25表达水平与同期常规治疗者相比,差异有显著性(P<0.05)。CD25 mRNA表达水平与CD25的表达具有平行性。IFN治疗者血清和PBMC内HBV-DNA阴转率均高于常规治疗者(P<0.05或P<0.01)。结论IFN-α2b对血清和PBMC内HBV-DNA均有较好阴转效果,阴转率明显高于常规治疗者。IFN-α2b可诱导T细胞活化,CD25表达水平增加,通过免疫调节发挥抗病毒作用。

促肝细胞生长素、IFN及IL－2对成纤维细胞增殖和分泌作用

本文探讨了促肝细胞生长素（ＰＨＧＦ）、重组干扰素ａ－２ｂ（ＩＦＮ）及白细胞介素２（ＩＬ─２）对体外培养成纤维细胞增殖的作用。结果表明，ＩＦＮ和ＩＬ─２可促进细胞的增殖和核分裂，发挥丝裂原作用。ＰＨＧＦ则抑制细胞增殖和核分裂，线粒体和粗面内质网变性，其培养上清羟脯氨酸（ＨＹＰ）水平降低。提示ＰＨＧＦ通过抑制成纤维细胞增殖和细胞产生ＨＹＰ的分泌作用，而发挥抗纤维化作用。Ｐ＜０．０１。讨论肝纤维化早期，细胞因子网络异常可导致肝纤维化的发生和发展〔２〕。据ＣｇａｊａＭＪ氏研究，ＩＦＮγ可减少胶原ｍＲＮＡ水平，抑制肝内纤维的产生〔３〕高春芳等报道，ＩＦＮ可促进体外培养肝细胞和Ｔ３细胞增殖，其机制不清〔４〕。ＩＬ─２是由Ｔ细胞产生的淋巴因子，在机体免疫调节中发挥重要作用。已有报道，慢性乙肝病人ＩＬ─１活性增强，与肝纤维化程度有关。其ＩＬ─２活性低下，与肝纤维化无相关性。〔５〕。本文结果表明，ＩＦＮ和ＩＬ─２单独作用于成纤维细胞，均促进细胞分裂，使其数量增多，核分裂明显增多，并使线粒体数量增多。线粒体的增生，可活跃细胞的生物氧化功能和蛋白质合成，促进其代谢和分化，从而发挥丝裂原的作用。ＨＹＰ是体内胶原纤维的主要成分，其含?

补肾强督方对强直性脊柱炎患者外周血IL-18、IFN-γ、IL-4 mRNA表达水平的影响

目的探讨补肾强督方治疗强直性脊柱炎(AS)的可能作用机制。方法30例AS患者予补肾强督方进行治疗,疗程为6个月。研究AS患者及健康志愿者外周血中白细胞介素18(IL-18)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4 mRNA(IL-4 mRNA)表达水平及经补肾强督方治疗前后AS患者外周血中IL-18、IFN-γ、IL-4 mRNA表达水平的变化。结果AS患者外周血单个核细胞IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA表达水平及IFN-γ mRNA/IL-4 mRNA较正常对照组显著增高(P<0.001)。经用补肾强督方治疗后,IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA表达水平及IFN-γ mRNA/IL-4 mRNA明显下降(P<0.001)。AS患者红细胞沉降率水平与IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平呈极显著相关(P<0.001);C反应蛋白水平与IL-18 mRNA表达水平呈显著相关(P<0.05),与IFN-γ mRNA表达水平呈非常显著相关(P<0.01)。结论AS患者外周血中IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA水平比正常组明显升高;用补肾强督方治疗后,患者IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA水平均有明显下降。

可在鱼体内表达hu-IFN-α的基因重组构建及转化

通过分子重组 ,将人α 干扰素 (hu IFN α)基因编码序列克隆到鲤鱼β 肌动蛋白基因启动子下游 ,构建成能在鱼体内组成型表达hu IFN α的基因重组分子。经限制性酶切分析、Southern杂交和序列测定 ,证明重组分子构建的正确性。采用显微注射法将这一重组基因转化草鱼受精卵 ,获得了表达人α

荨麻疹患者外周血单个核细胞产生IL-4、IL-10及IFNγ水平及意义

为研究荨麻疹患者外周血单个核细胞(PBMC)产生白细胞介素-4(IL-4),白细胞介素-10(IL-10)及γ干扰素(IFNγ)的水平,采用双抗体夹心ELISA方法,测定了23例荨麻疹患者PBMC产生IL-4、IL-10及IFNγ水平。结果表明荨麻疹患者PBMC产生IL-4水平明显高于正常人(P<0.01),而产生IL-10及IFNγ水平与正常人相差不显著(P>0.05)。IL-4在Ⅰ型变态反应荨麻疹发病中可能起一定作用。

牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。