siRNA沉默SOCS1表达增强IFN-α2a-NGR的抗肿瘤效应

目的:研究肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR抗肿瘤效应的分子机制,发现影响干扰素敏感性的关键信号分子,提高耐药肿瘤细胞敏感性。方法:培养IFNAR高表达细胞株A549、IFNAR低表达细胞株MKN-45,通过MTT检测IFN-α2a-NGR的抗细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)、Western blot检测IFN-α2a-NGR处理前后STAT1、p-STAT1、p53、OAS与SOCS1的表达变化,合成siRNA靶向干涉SOCS1。结果:IFN-α2a-NGR刺激后,A549中,p-STAT1、p53、OAS与SOCS1表达上调;MKN-45中P53、OAS无显著变化,SOCS1显著上调。靶向干涉SOCS1后,MKN-45对IFN-α2a-NGR的敏感性增加[抑制率从(14.69±1.05)%提高到(36.97±2.05)%]。结论:IFN-α2a-NGR与IFN-α2a在细胞和分子水平的效应基本一致,p-STAT1、p53与SOCS1可影响细胞对干扰素的敏感性,通过siRNA沉默技术可提高耐药细胞株敏感性,为IFN-α2a-NGR的进一步研发奠定了基础。

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的 :观察应用重组IFN α2a能否增强单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因 (HSV tk) /丙氧鸟苷 (GCV)系统对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应。方法 :利用逆转录病毒载体将潮霉素磷酸转移酶和HSV tk的融合基因 (hytk)导入SKOV3细胞 ,测定GCV对SKOV3/hytk细胞的杀伤作用和旁观者效应。观察IFN α2a与HSV tk/GCV协同作用对旁观者效应的影响 ,并且在联合应用GCV和IFN α2a后 ,进行细胞周期分析。结果 :GCV对SKOV3/hytk细胞有明显的杀伤作用 ,并且可以同时杀伤周围未转基因的细胞 ,联合应用IFN α2a与HSV tk/GCV可以明显增强旁观者效应 (P <0 .0 5 ) ,使处于S期的SKOV3/hytk细胞较对照组和使用单药组明显增多 (P <0 .0 1)。结论 :IFN α2a与HSV tk/GCV联合应用可以产生协同作用 ,增强HSV tk/GCV系统在体外对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应 。

IFN-α2a对多发性硬化患者外周血中免疫抑制因子IL-10的影响

目的观察重组人干扰素α－２ａ对ＭＳ的治疗效果，探讨其治疗机理。方法采用ＥＬＩＳＡ夹心法检 测２２例ＭＳ患者治疗前后血清中ＩＬ－１０浓度，结合临床疗效进行对比分析。结果重组人干扰素α－２ａ治疗组患者 血清中ＩＬ－１０浓度明显增高，临床症状明显改善，与对照组比较差异有显著意义。结论重组人干扰素ＩＦＮ－α２ａ可 提高ＭＳ患者体内ＩＬ－１０水平，对ＭＳ有良好疗效。

肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合应用对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组蛋白肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与化疗药物5-氟尿嘧啶联合使用在体外对人非小细胞肺癌细胞株A549的作用,为IFN-α2a-NGR的临床实验设计提供实验依据。方法:不同浓度的肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR、5-氟尿嘧啶单独及联合作用于细胞株A549,通过MTT法检测单药及联合用药对细胞增殖的影响,经AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察药物作用的细胞形态。结果:IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合作用于A549细胞株时,其细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均较单独作用时高,具有统计学显著性差异(P<0.05);荧光显微镜观察可见药物作用后细胞形态改变。结论:肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。

重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。

表达α-2a干扰素工程菌的大型罐级联控制溶氧发酵研究

用500L大型发酵罐级联控制溶氧培养表达α－2a干扰素的大肠杆菌，获得了菌体生长与培养时间呈直线关系的结果（b＝6．668，r＝0．9963，P＜0．01）。多批实验结果证明，菌体单产（g／L）为36.148±2.13，菌体罐产（g／罐）为11613±210.06，IFN活性为5.086±2.93（×108Iu／L）。

基因工程人干扰素α2b和α2a亚型抗病毒效应的实验研究

本文采用鸡胚接种法和微量细胞病变抑制法研究了不同亚型α干扰素（α２ａＩＦＮ和α２ｂＩＦＮ）抗流感病毒、脊髓灰质炎病毒以及麻疹病毒的作用。结果表明：两种亚型α干扰素均显示明显的抗病毒效应，其中（１）α２ｂＩＦＮ抗流感病毒作用略强于α２ａＩＦＮ，（２）两亚型α干扰素抗脊髓灰质炎和麻疹病毒作用相似。

左甲状腺素对接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗的丙型肝炎患者发生抑郁焦虑的影响

目的观察应用小剂量左甲状腺激素对接受聚乙二醇干扰素α-2a(PEG-IFN-α2a)治疗的丙型肝炎患者发生抑郁、焦虑的影响作用。方法将54例不同年龄和性别的慢性丙型病毒性肝炎患者,分为3组,老年女性组、老年男性组、中青年组。对不同性别和年龄慢性丙型肝炎患者在干扰素治疗前和治疗后12周后利用Zung抑郁症自测量表(ZDS)和Zung焦虑症自测量表(ZAS)进行心理测评,对出现抑郁症的患者(21/54)给予小剂量左甲状腺激素口服,(12.5～25)μg/d,并继续应用干扰素治疗,测试4周后ZDS、ZAS积分,对左甲状腺激素治疗前后的ZDS、ZAS积分进行统计学分析。结果 PEG-IFN-α2a治疗后,老年女性组更容易发生抑郁和焦虑,对已发生抑郁的患者给予小剂量左甲状腺激素口服后ZDS和ZAS总分显著低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。结论小剂量左甲状腺激素能够提高患者甲状腺激素水平,减少PEG-IFN-α2a所致抑郁和焦虑的发生率,达到患者顺利完成抗病毒治疗。

干扰素-α致老年丙型肝炎患者抑郁与Th1/Th2型细胞因子的相关分析

目的探讨干扰素-α致老年丙型肝炎患者抑郁症时Th1/Th2细胞因子失衡的变化情况。方法用半定量逆转录聚合酶链反应技术检测20例正常对照、54例丙型肝炎患者干扰素-α治疗12周时外周血单个核细胞内干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)mRNA表达水平变化情况,同时应用Zung抑郁症自测量表(ZDS)对患者进行心理评估,然后对两组数据分析比对,进行相关性研究。结果老年女性丙型肝炎患者经过干扰素-α治疗后,抑郁积分数值明显增加,与中青年女性组患者以及老年男性组患者相比有显著性差异,且存在Th1/Th2细胞因子失衡,倾向于Th1,两者之间存在一定相关性。结论干扰素-α治疗丙型肝炎过程中,在老年女性患者更容易出现Th1/Th2细胞因子失衡和抑郁症状。

酿酒酵母重组人α2a干扰素补料分批培养

在 2 .6L全自动发酵罐中对人 α2 a干扰素重组酵母的补料分批培养过程作了初步研究。结果表明 ,培养过程中待葡萄糖耗尽时流加葡萄糖 ,并维持低糖浓度 ;在培养 1 0 h～ 2 0 h时 ,恒速流加 2 0 mg/L的腺嘌呤 ,能较大幅度提高表达水平 ,生物活性从原工艺的 3.1× 1 0 9IU/L提高至1 .3× 1 0 10 IU/L。表达期 p H值对生产水平有很大影响 ,宜控制在 5.0～ 5.

重组人干扰素α2a和GFE-1多肽融合基因的克隆、表达及活性测定

目的:构建IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因表达载体,获得高质量生物产品。方法:应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)α2a3'端酶切位点进行改造,人工合成编码能特异性高效结合肺组织的GFE-1寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM3Zf质粒,进行序列分析,将融合蛋白基因克隆入pBV220表达载体,在大肠杆菌中表达,对IFN-α2a-GFE-1表达产物纯化、鉴定及体外活性检测。结果:利用PCR的方法成功地改造了IFN-α2a3'端酶切位点,成功的将GFE-1多肽与IFN-α2a3'端连接,构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白的基因克隆载体pGEM3Zf-GFE-1,DNA测序完全正确。构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因原核表达载体pBV220-IFN-α2a-GFE-1,经温度诱导在大肠杆菌中有效表达。纯化了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大95%,比活性达5.8×109U/mg。结论:IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因的成功克隆、表达、纯化和活性测定,为研制一种具有导向性治疗肺癌、肺纤维化等疾病的有效药品奠定基础。

干扰素-α2a对流感病毒感染的MDCK作用的研究

目的探讨干扰素-α2a对甲型流感病毒感染的狗肾传代细胞系(MDCK)的作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察不同浓度(0.01、0.1、1、10、100U/ml)IFN-α2a在H3N2病毒感染MDCK0h、1h和4h后对细胞活性的影响。结果不同浓度的IFN-α2a能抑制正常生长及病毒感染1h、4h后的MDCK的增殖,但能促进病毒感染0h后的MDCK的生长,其中1.0U/ml组与对照组相比有显著差异(P<0.01)。结论IFN-α2a除了可抑制MDCK生长之外,还能促进H3N2感染初期细胞的增殖。

人LL-37与干扰素α2a密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达

通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人LL-37与IFN-α2a融合蛋白。先按P.pastoris密码子偏好性对LL-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上Gly Gly Gly Gly Ser的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过p PIC9K载体将其整合入P.pastoris GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出LL-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有LL-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。

干扰素对甲型流感病毒感染的JEC细胞增殖的影响

目的探讨干扰素-α2a(IFN-α2a)对甲型流感病毒post-infected感染的JEC细胞增殖的影响。方法采用不同浓度的IFN-α2a作用于H3N2感染0、1、4h的JEC细胞,用MTT比色法在病毒感染后24h进行检测。结果IFN-α2a作用于病毒感染0h、1h后的JEC组OD值升高,而病毒感染4h后的JEC组的OD值却降低。结论IFN-α2a可促进流感病毒H3N2感染初期JEC的增殖,但却抑制感染后期JEC的生长。