重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。

siRNA沉默SOCS1表达增强IFN-α2a-NGR的抗肿瘤效应

目的:研究肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR抗肿瘤效应的分子机制,发现影响干扰素敏感性的关键信号分子,提高耐药肿瘤细胞敏感性。方法:培养IFNAR高表达细胞株A549、IFNAR低表达细胞株MKN-45,通过MTT检测IFN-α2a-NGR的抗细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)、Western blot检测IFN-α2a-NGR处理前后STAT1、p-STAT1、p53、OAS与SOCS1的表达变化,合成siRNA靶向干涉SOCS1。结果:IFN-α2a-NGR刺激后,A549中,p-STAT1、p53、OAS与SOCS1表达上调;MKN-45中P53、OAS无显著变化,SOCS1显著上调。靶向干涉SOCS1后,MKN-45对IFN-α2a-NGR的敏感性增加[抑制率从(14.69±1.05)%提高到(36.97±2.05)%]。结论:IFN-α2a-NGR与IFN-α2a在细胞和分子水平的效应基本一致,p-STAT1、p53与SOCS1可影响细胞对干扰素的敏感性,通过siRNA沉默技术可提高耐药细胞株敏感性,为IFN-α2a-NGR的进一步研发奠定了基础。

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的 :观察应用重组IFN α2a能否增强单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因 (HSV tk) /丙氧鸟苷 (GCV)系统对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应。方法 :利用逆转录病毒载体将潮霉素磷酸转移酶和HSV tk的融合基因 (hytk)导入SKOV3细胞 ,测定GCV对SKOV3/hytk细胞的杀伤作用和旁观者效应。观察IFN α2a与HSV tk/GCV协同作用对旁观者效应的影响 ,并且在联合应用GCV和IFN α2a后 ,进行细胞周期分析。结果 :GCV对SKOV3/hytk细胞有明显的杀伤作用 ,并且可以同时杀伤周围未转基因的细胞 ,联合应用IFN α2a与HSV tk/GCV可以明显增强旁观者效应 (P <0 .0 5 ) ,使处于S期的SKOV3/hytk细胞较对照组和使用单药组明显增多 (P <0 .0 1)。结论 :IFN α2a与HSV tk/GCV联合应用可以产生协同作用 ,增强HSV tk/GCV系统在体外对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应 。

肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合应用对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组蛋白肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与化疗药物5-氟尿嘧啶联合使用在体外对人非小细胞肺癌细胞株A549的作用,为IFN-α2a-NGR的临床实验设计提供实验依据。方法:不同浓度的肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR、5-氟尿嘧啶单独及联合作用于细胞株A549,通过MTT法检测单药及联合用药对细胞增殖的影响,经AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察药物作用的细胞形态。结果:IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合作用于A549细胞株时,其细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均较单独作用时高,具有统计学显著性差异(P<0.05);荧光显微镜观察可见药物作用后细胞形态改变。结论:肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。

肿瘤靶向性RGD-IFN-α2a融合蛋白在原核细胞中的表达与纯化

RGD肽是一类含有精氨酸．甘氨酸-天冬氨酸（Arg—Gly—Asp）的短肽，作为整合素和其配体相互作用的识别位点，能与肿瘤细胞或肿瘤组织新生血管特异性高表达的某些整合素如αV β3结合，从而将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位，有效减少肿瘤治疗中对正常组织细胞的损害，提高药物本身疗效。干扰素（interferon，IFN）是一类重要的细胞因子，具有抗病毒、抑制某些细胞生长、免疫调节、抑制和杀伤肿瘤细胞等多种作用，在临床上已被广泛用于恶性肿瘤与病毒疾病的治疗。

IFN-α2a-GFE-1融合基因的构建及表达

目的 构建IFN -α 2a -GFE - 1融合基因载体 ,检测其在转染细胞的表达 ,为肺癌基因导向药物治疗积累实验资料。方法 应用聚合酶链式反应技术 (PCR)对干扰素 (IFN) -α 2a羧基端的酶切位点进行改造 ,并人工合成肺特异性结合多肽CGFECVRQCPERC(GFE - 1)的寡核苷酸片段 ,二者连接后克隆入pGEM - 3zf质粒 ,连接产物转化感受态DH5α细胞 ,挑选阳性克隆经EcoRⅠ +PstⅠ酶切鉴定后测序 ,将测序正确的目的基因从测序载体相应酶切位点消化回收并纯化后 ,与上述酶处理过的PBV2 2 0质粒连接 ,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经筛选后随机挑选阳性菌落 ,提取质粒酶切鉴定。结果 序列分析表明合成片段成功的插入IFN -α 2a羧基端 ,大小、位置、方向均正确无误 ;融合基因克隆入PBV 2 2 0表达载体在大肠杆菌中获得有效表达。结论 IFN -α 2a -GFE - 1融合基因载体的构建及表达 。

IFN-α2a对多发性硬化患者外周血中免疫抑制因子IL-10的影响

目的观察重组人干扰素α－２ａ对ＭＳ的治疗效果，探讨其治疗机理。方法采用ＥＬＩＳＡ夹心法检 测２２例ＭＳ患者治疗前后血清中ＩＬ－１０浓度，结合临床疗效进行对比分析。结果重组人干扰素α－２ａ治疗组患者 血清中ＩＬ－１０浓度明显增高，临床症状明显改善，与对照组比较差异有显著意义。结论重组人干扰素ＩＦＮ－α２ａ可 提高ＭＳ患者体内ＩＬ－１０水平，对ＭＳ有良好疗效。

乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中s IL-2R、炎前因子和IFN-α2a水平变化及其临床意义

炎前因子主要包括白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α,）这4种单核因子是介导体内炎症反应和一系列病理生理过程的重要介质。

IFN-α2b对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞内HBV-DNA阴转和对CD25的诱导作用

目的探讨IFNα2b对慢性乙型肝炎患者HBVDNA的治疗效果及对CD25的诱导作用。方法将患者分为A(66例)、B(44例)两组,分别采用IFNα2b和常规治疗,PCR法动态检测患者外周血单个核细胞(PBMC)内和血清中HBVDNA,生物素链霉亲和素(BSA)法检测CD25表达水平,实时(realtime)PCR法检测CD25mRNA含量,动态检测抗IFNIgG水平。结果IFNα2b治疗24、48周后,患者PBMC内、血清中HBVDNA和HBeAg阴转率分别为36.36%、39.39%、40.91%和42.42%、51.52%、53.03%,与常规组相比差异有显著性(P<0.05～P<0.01);干扰素治疗后,ALT、AST、ALT/AST水平分别为(33.4±12.6)U/ml、(34.3±10.7)U/ml、(0.9±0.2)U/ml,与常规组相比差异有显著性(P<0.01);慢性乙型肝炎患者静息态和诱导态CD25水平均降低,干扰素治疗后,静息态和诱导态CD25水平显著升高,其CD25mRNA含量亦同步升高,与常规组相比差异有显著性(P<0.01);IFNα2b治疗48周抗IFNIgG阳性率仅6.06%,与常规组相比差异无显著性(P>0.05)。结论IFNα2b对PBMC、血清HBVDNA和HBeAg均有较好阴转效果,阴转率明显高于常规疗法;IFNα2b可诱导慢性乙型肝炎患者表达CD25,促进T细胞活化发挥抗病毒作用;IFNα2b自身免疫原性较弱,治疗过程中诱导机体产生低水平的抗IFNIgG,对IFNα2b的抑制作用较弱。

突变和修饰IFN-α2b基因的5’和3’端对其在E.coli表达的调控作用

目的对人 IFN- α2 b基因进行突变和修饰 ,从翻译水平上调控 IFN- α2 b基因在大肠杆菌中的表达。方法采用PCR技术 ,人工合成寡核苷酸引物 ,对人 IFN- α2 b基因进行了改造 :在不改变氨基酸的前提下 ,将 5’端编码区的四个 G、C位点突变为 A、T;去除 3’端非编码区。将突变和修饰后的基因片段分别克隆入原核表达载体 p BV32 1,在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行活性效价测定。结果 3’端删除非编码区 ,表达水平比删除前提高 4倍 ;5’端四个位点突变 ,表达水平比突变前降低 2倍。结论 IFN-α2 b基因的 3’端非编码区抑制其在原核系统的表达 。

IFN-α2b体外对人眼葡萄膜黑色素瘤细胞端粒酶活性的影响

目的:研究端粒酶抑制剂IFN-α2b对人葡萄膜黑色素瘤细胞端粒酶活性的抑制作用。方法:采用原代培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞,用特定时间下不同浓度以及特定浓度下不同时间的端粒酶抑制剂IFN-α2b作用于体外培养的黑色素瘤细胞,并设立空白对照组。采用PCR-ELISA法及PCR-PAGE法测定细胞中端粒酶活性的变化,采用单因素方差进行统计分析。结果:随着IFN-α2b浓度的增加及作用时间的延长,端粒酶的活性出现逐步的下降,在药物浓度达到50kU/L以及作用时间达到24h后,出现明显的抑制作用,并在500kU/L及48h达到抑制高峰。结论:IFN-α2b可有效降低体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞的端粒酶活性,并呈浓度和时间依赖性。

肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中SIL-2R、炎前因子和IFN-α2a的检测及相关性研究

肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中ＳＩＬ—２Ｒ、炎前因子和ＩＦＮ—α２ａ的检测及相关性研究解放军第４６３医院（１１００４２）王茸李正求第四军医大学金伯泉杨王昆解放军８６６３４４部队王萌近年来，国内外学者对肝炎、肝硬化、肝癌的免疫状态进行了大量的研究，发现免...

甲型肝炎患者外周血sIL-2R、炎前因子、IFN-α2a水平变化

目的:检测甲型肝炎患者血清sIL-2R、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α2a水平,并探讨在甲型肝炎发病过程中的作用及其相关性。方法:采用夹心ELISA法。结果:sIL-2R、IL-6水平分别为311.9±140.2U/ml、144.3±115.6pg/ml,IL-8、TNF-α和IFN-α2a阳性率也均高于正常对照组。结论:提示sIL-2R、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α2a测定对于甲型肝炎病情监测和指导临床判断疗效是一类新的、有意义的指标。

HPLC MALDI-TOF质谱法检测IFN-α2b二硫键结构

目的采用TPCK胰酶酶切、高效液相色谱(HPLC)法与MALDI-TOF MS质谱法联用解析重组人干扰素α2b(recombinant human interferonα2b,rh IFN-α2b)的二硫键连接位置;建立活性多肽/蛋白质二硫键连接位置定位的分析方法。方法首先验证rh IFN-α2b是否有游离半胱氨酸,然后通过TPCK胰蛋白酶酶切rh IFN-α2b蛋白质,HPLC-RPC法分离酶切样品并按峰分别收集各个肽段样品;采用质谱解析分子量和二次质谱肽段氨基酸系列测序,获得rh IFN-α2b的胰酶肽图;比对还原型与非还原型的胰酶肽图,找出差异肽段,并于理论胰酶酶切肽段比较,最终确定rh IFN-α2b的二硫键位置。结果 rh IFN-α2b的二硫键位置与文献报道的天然人干扰素α2b的二硫键位置一致,为Cys1-Cys98、Cys29-Cys138。结论建立了胰酶酶切、高效液相色谱(HPLC)法与MALDI-TOF MS质谱法联用测定活性多肽/蛋白质二硫键的分析方法,为今后蛋白质类药物的二硫键位置定位提供可靠分析手段。

表达α-2a干扰素工程菌的大型罐级联控制溶氧发酵研究

用500L大型发酵罐级联控制溶氧培养表达α－2a干扰素的大肠杆菌，获得了菌体生长与培养时间呈直线关系的结果（b＝6．668，r＝0．9963，P＜0．01）。多批实验结果证明，菌体单产（g／L）为36.148±2.13，菌体罐产（g／罐）为11613±210.06，IFN活性为5.086±2.93（×108Iu／L）。

三种IFN-α抗病毒活性新方法的比较

目的:体外研究不同亚型干扰素-α(IFN-α2b,IFN-α2a,IFN-α1b)抗HBV活性和信号分子基因应答水平的差异性,以探讨用信号分子作为一种新的抗病毒评价标准的可能性.方法:0.5,1,2,4,8MU/LIFN-α2b,IFN-α2a,IFN-α1b作用于2.2.15细胞后,用Abbott诊断试剂盒分别检测上清中HBsAg,HBeAg的含量,并计算其抑制率;1MU/LIFN-α2b,IFN-α2a,IFN-α1b作用于HepG2细胞后,利用RT-PCR及Westernblotting方法检测胞内STAT1,IFNARmRNA及蛋白表达水平的差异性.结果:IFN-α对HBsAg,HBeAg抑制率随药物浓度增加而增强,当IFN-α浓度为0.5,1MU/L时,三组不同亚型IFN-α对HBsAg,HBeAg抑制率无统计学差异.当浓度为2,4,8MU/L时,IFN-α1b组对HBsAg,HBeAg抑制率明显较IFN-α2b,IFN-α2a组高(HBsAg:F=4.51,6.23;HBeAg:F=3.11,4.72,P<0.05),而IFN-α2b,IFN-α2a组间无统计学差异.RT-PCR和Westernblotting结果1Mu/L时,IFN-α1b处理组IFNAR,STAT1mRNA及蛋白表达水平均较IFN-α2b组高,两组比较无统计学差异.IFN-α1b,IFN-α2b处理组IFNAR,STAT1mRNA及蛋白表达水平明显较IFN-α2a组高,均存在统计学差异(mRNA:F=5.26,15.6;蛋白:F=17.7,20.1,P<0.05).结论:IFN-α1b,IFN-α2b抗HBV活性较强,IFN-α2a较弱.用信号分子STAT1,IFNAR来评价IFN-α抗病毒活性则更为敏感.

初诊系统性红斑狼疮患者血清25羟维生素D与炎性细胞因子的相关性

目的探讨25羟维生素D(25-OH-VitD)在中国汉族初诊系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血的水平及其与α2干扰素(IFN-α2)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10和IL-17A的相关性。方法收集86例初诊SLE患者和73例健康对照组血清。分别采用ELISA检测25-OH-VitD,Luminex液相芯片技术检测IFN-α2、IL-6、IL-10和IL-17A水平。采用Spearman检验分析25-OH-VitD与细胞因子、临床表现及C3、24 h尿蛋白定量的相关性。结果 SLE患者血清25-OH-VitD水平明显低于对照组。SLE患者血清25-OH-VitD水平与补体C3水平正相关,与IL-17A水平和24 h尿蛋白定量水平负相关;而与IFN-α2、IL-6和IL-10无相关性。结论初诊SLE患者血清25-OH-VitD水平降低,并与IL-17A有负相关关系。