IFN-α2b对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞内HBV-DNA阴转和对CD25的诱导作用

目的探讨IFNα2b对慢性乙型肝炎患者HBVDNA的治疗效果及对CD25的诱导作用。方法将患者分为A(66例)、B(44例)两组,分别采用IFNα2b和常规治疗,PCR法动态检测患者外周血单个核细胞(PBMC)内和血清中HBVDNA,生物素链霉亲和素(BSA)法检测CD25表达水平,实时(realtime)PCR法检测CD25mRNA含量,动态检测抗IFNIgG水平。结果IFNα2b治疗24、48周后,患者PBMC内、血清中HBVDNA和HBeAg阴转率分别为36.36%、39.39%、40.91%和42.42%、51.52%、53.03%,与常规组相比差异有显著性(P<0.05～P<0.01);干扰素治疗后,ALT、AST、ALT/AST水平分别为(33.4±12.6)U/ml、(34.3±10.7)U/ml、(0.9±0.2)U/ml,与常规组相比差异有显著性(P<0.01);慢性乙型肝炎患者静息态和诱导态CD25水平均降低,干扰素治疗后,静息态和诱导态CD25水平显著升高,其CD25mRNA含量亦同步升高,与常规组相比差异有显著性(P<0.01);IFNα2b治疗48周抗IFNIgG阳性率仅6.06%,与常规组相比差异无显著性(P>0.05)。结论IFNα2b对PBMC、血清HBVDNA和HBeAg均有较好阴转效果,阴转率明显高于常规疗法;IFNα2b可诱导慢性乙型肝炎患者表达CD25,促进T细胞活化发挥抗病毒作用;IFNα2b自身免疫原性较弱,治疗过程中诱导机体产生低水平的抗IFNIgG,对IFNα2b的抑制作用较弱。

突变和修饰IFN-α2b基因的5’和3’端对其在E.coli表达的调控作用

目的对人 IFN- α2 b基因进行突变和修饰 ,从翻译水平上调控 IFN- α2 b基因在大肠杆菌中的表达。方法采用PCR技术 ,人工合成寡核苷酸引物 ,对人 IFN- α2 b基因进行了改造 :在不改变氨基酸的前提下 ,将 5’端编码区的四个 G、C位点突变为 A、T;去除 3’端非编码区。将突变和修饰后的基因片段分别克隆入原核表达载体 p BV32 1,在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行活性效价测定。结果 3’端删除非编码区 ,表达水平比删除前提高 4倍 ;5’端四个位点突变 ,表达水平比突变前降低 2倍。结论 IFN-α2 b基因的 3’端非编码区抑制其在原核系统的表达 。

IFN-α2b体外对人眼葡萄膜黑色素瘤细胞端粒酶活性的影响

目的:研究端粒酶抑制剂IFN-α2b对人葡萄膜黑色素瘤细胞端粒酶活性的抑制作用。方法:采用原代培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞,用特定时间下不同浓度以及特定浓度下不同时间的端粒酶抑制剂IFN-α2b作用于体外培养的黑色素瘤细胞,并设立空白对照组。采用PCR-ELISA法及PCR-PAGE法测定细胞中端粒酶活性的变化,采用单因素方差进行统计分析。结果:随着IFN-α2b浓度的增加及作用时间的延长,端粒酶的活性出现逐步的下降,在药物浓度达到50kU/L以及作用时间达到24h后,出现明显的抑制作用,并在500kU/L及48h达到抑制高峰。结论:IFN-α2b可有效降低体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞的端粒酶活性,并呈浓度和时间依赖性。

IFN-α2b对慢性乙肝患者抗病毒及免疫调节作用

目的探讨IFN-α2b对慢性乙肝患者抗病毒效果及对CD25的免疫调节作用。方法选择160例慢性乙肝患者(轻度93例,中度67例),随机分为IFN和常规治疗组,用生物素-链霉亲和素(BSA)法和Real-time PCR法分别动态检测PHA诱导前后CD25和CD25 mRNA的表达水平,PCR法动态检测患者治疗前后HBV-DNA水平。结果轻、中度组患者经干扰素治疗后,静息态和诱导态CD25表达水平逐渐升高,其CD25 mRNA含量亦升高。第3疗程后,轻、中度组中以干扰素治疗者CD25表达水平与同期常规治疗者相比,差异有显著性(P<0.05)。CD25 mRNA表达水平与CD25的表达具有平行性。IFN治疗者血清和PBMC内HBV-DNA阴转率均高于常规治疗者(P<0.05或P<0.01)。结论IFN-α2b对血清和PBMC内HBV-DNA均有较好阴转效果,阴转率明显高于常规治疗者。IFN-α2b可诱导T细胞活化,CD25表达水平增加,通过免疫调节发挥抗病毒作用。

[H^+]对LAK细胞、rIL-2、IFN-α2b或联合ADM抗恶性肿瘤的影响

目的 调节细胞培养液pH值,观察不同pH值对LAK细胞的增值和rIL-2、IFN-α2b、LAK细胞杀伤恶性细胞的影响。方法 采用淋巴细胞分离液梯度离心法从正常人外周血分离单个核细胞并用rIL-2激活,于96孔细胞培养板或培养管中培养。应用细胞计数方法观察pH值分别为6.8、7.3、7.6的培养液,对rIL-2激活单个核细胞的影响。用7404细胞作为靶细胞、MTT法测定培养液pH值分别为6.8、7.3、7.6状态下rIL-2、IFN-α2b的杀伤作用,以及IFN--α2b对ADM(阿霉素)的增效作用和LAK细胞的细胞毒性作用。结果 pH值为7.3、7.6状态下,有利于LAK细胞增殖,pH值为7.6状态下rIL-2、IFN-α2b、LAK细胞杀伤效果最佳;pH值为6.8状态下几乎无杀伤作用。pH值为6.8、7.6都不利于7404细胞生长,pH值为7.6有利于LAK细胞生长。pH值为6.8、7.3、7.6时,IFN-α2b都能增加ADM抗肿瘤作用,但pH值为7.6时,IFN-α2b+ADM杀伤效果最佳。结论 在偏碱性环境下,有利于LAK细胞增殖,并且在此状态下LAK细胞和rIL-2、IFN-α2b、IFN-α2b+ADM对肿瘤细胞杀伤效果最佳。

体内观察IFN-α2b对慢性乙肝患者CD25的免疫诱导作用

[目的]探讨在体内IFN-α2b(干扰素-α2b)对慢性乙肝患者CD25(白细胞分化抗原25)的免疫诱导作用及其抗病毒效果。[方法]采用临床试验将110例典型慢性乙肝患者根据病情分为轻度组(65例),中度组(45例),并给予IFN-α2b治疗3疗程(每疗程12周)。每疗程前后,应用生物素-链霉亲和素(BSA)法和RT-PCR法动态检测体外PHA诱导前后患者PBMC的CD25和CD25 mRNA的表达水平,PCR法动态检测患者外周血单个核细胞(PBMC)内和血清中HBV-DNA。[结果]轻度组和中度组患者经干扰素治疗后的静息态和诱导态CD25表达水平逐渐升高,其CD25 mRNA含量亦同步升高,但与正常对照组仍存在不同差异性(P﹤0.05或P﹤0.01)。IFN-α2b治疗36周后,患者PBMC内、血清中HBV-DNA和HBeAg阴转率两组分别为29(44.62%)、26(40.00%)、39(60.00%)和11(24.44%)、9(20.00%)、17(37.78%),差异有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]IFN-α2b可诱导慢性乙肝患者表达CD25,促进T细胞活化发挥抗病毒作用。此效果轻度组高于中度组,似与患者病情程度相关。

同位素法体内示踪HSA-IFN-α2b的方法学研究

采用氯胺-T法制备了^(125)I-HSA-IFN-α2b,标记率为82.7%,放化纯度>95%,放射性比活度为O.26 TBq/g。体外WISH/VSV系统抗病毒活性分析表明,^(125)I标记对HSA-IFN-β2b的生物学活性几乎无影响。^(125)I-HSA-IFN-α2b的血清和各组织的回收率分别为102.0%、104.0%(心脏)、100.4%(肺)、100.9% (肝)、104.1%(脾)、101.4%(肾)和103.0%(小肠),均符合方法学考核中回收率达90%～110%的要求。^(125)I-HSA-IFN-α2b的溶液干扰、血清样品干扰和组织样品干扰实验的结果表明,溶液、血清和组织样品对测定均无干扰,可以直接进行测定。根据实验结果可以初步推断,采用^(125)I-HSA-IFN-α2b同位素示踪法进行HSA-IFN-α2b的体内分布排泄研究是可行的。

HPLC MALDI-TOF质谱法检测IFN-α2b二硫键结构

目的采用TPCK胰酶酶切、高效液相色谱(HPLC)法与MALDI-TOF MS质谱法联用解析重组人干扰素α2b(recombinant human interferonα2b,rh IFN-α2b)的二硫键连接位置;建立活性多肽/蛋白质二硫键连接位置定位的分析方法。方法首先验证rh IFN-α2b是否有游离半胱氨酸,然后通过TPCK胰蛋白酶酶切rh IFN-α2b蛋白质,HPLC-RPC法分离酶切样品并按峰分别收集各个肽段样品;采用质谱解析分子量和二次质谱肽段氨基酸系列测序,获得rh IFN-α2b的胰酶肽图;比对还原型与非还原型的胰酶肽图,找出差异肽段,并于理论胰酶酶切肽段比较,最终确定rh IFN-α2b的二硫键位置。结果 rh IFN-α2b的二硫键位置与文献报道的天然人干扰素α2b的二硫键位置一致,为Cys1-Cys98、Cys29-Cys138。结论建立了胰酶酶切、高效液相色谱(HPLC)法与MALDI-TOF MS质谱法联用测定活性多肽/蛋白质二硫键的分析方法,为今后蛋白质类药物的二硫键位置定位提供可靠分析手段。

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体，构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ，通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因，免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖，诱导特异性 ＣＴＬ反应，当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平，构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。

IFN-α2b对JAK2V617F突变的骨髓增殖性肿瘤COX-2表达及血管新生的影响

目的研究干扰素-alpha-2b(IFN-α2b)对骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者JAK2激酶、环氧化酶-2(COX-2)及微血管密度的影响及人红白血病HEL细胞系中JAK2V617F与COX-2之间的关系。方法收集在保定市第一医院接受初次治疗的42例有JAK2V617F突变的MPN患者,其中17例患者为IFN-α2b治疗组(给予IFN-α2b肌肉注射治疗),25例为初治组(未行治疗)。另取同期10例特发性免疫性血小板减少性紫癜(ITP)患者作为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测MPN患者JAK2V617F/JAK2突变量,免疫组化检测MPN患者和ITP患者骨髓病理组织p-JAK2、COX-2及CD105标记的微血管密度(MVD)。用不同浓度IFN-α2b作用于HEL细胞系,CCK-8检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测凋亡率,Transwell小室检测细胞迁移能力,半定量PCR检测HEL细胞中JAK2、COX-2mRNA表达水平,Western blot检测p-JAK2、COX-2蛋白表达水平。结果初治组患者p-JAK2、COX-2表达水平及MVD高于对照组,IFN-α2b治疗后患者p-JAK2、COX-2及MVD表达水平减低。不同剂量IFN-α2b作用HEL细胞48h,细胞增殖抑制率和细胞凋亡率随其剂量增加逐渐上升,JAK2及COX-2mRNA及p-JAK2、COX-2蛋白表达随其剂量增加逐渐降低。细胞迁移实验结果发现加入0.5×104 U/L IFN-α2b处理HEL细胞24h,迁移至下室的细胞数低于对照组(P<0.05)。结论 IFN-α2b通过调控JAK2信号通路抑制COX-2及MPN患者血管新生。

干扰素-γ、干扰素-α2b联合应用诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡及机制

目的研究干扰素-γ、于扰素-α2b联合应用对MCF-7乳腺癌细胞的诱导凋亡作用及其机制。方法流式细胞仪(FCM)检测处理后细胞凋亡及Fas/FasL蛋白表达情况。结果处理后凋亡细胞百分率及FasL的表达增加,随着处理时间的延长,表达有增加趋势,差异有统计学意义(P<0.05);Fas的表达无明显变化。结论干扰素-γ、干扰素-α2b联合应用可诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,机制可能与上调FasL的表达,加强Fas/FasL之间的交联及使Fas/FasL通路敏感性增加有关。

狂犬病疫苗与干扰素α2b联合应用对小鼠的保护效果

[目的]研究IFN-α2b与狂犬病纯化疫苗对小白鼠的保护效果。[方法]将IFN-α2b与狂犬病纯化疫苗按不同的免疫程序应用于6个试验组中。1组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,0、37、1、4 d免疫;2组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,同时腹腔注射IFN-α2b 1 500IU/只,0、3、71、4 d免疫;3:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,0、37、d免疫;4组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,同时腹腔注射IFN-α2b1 500 IU/只,03、7、d免疫;5组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,03、、71、4 d免疫,于0、12、d腹腔注射IFN-α2b 1 500 IU/只;6组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,0、3、71、4 d免疫,于0、12、、37、1、4 d腹腔注射IFN-α2b 1 500 IU/只。34、组于第9天攻击,12、、56、组于第21天攻击后计算其保护率。[结果]狂犬病疫苗与IFN-α2b联合应用组其保护率明显高于其他组,且按免疫程序同时应用IFN-α2b组其保护率最高。[结论]按狂犬病疫苗免疫程序同时应用IFN-α2b组其免疫效果最好,保护率最高。而提前应用IFN-α2b并没有增强狂犬病疫苗的保护率。

干扰素-α2b抗肿瘤作用临床Ⅱ期观察

自80年代初基因重组干扰素(IFN)问世以来,IFN的抗肿瘤作用的研究有了很大的进展。特别是IFN-α2b的临床研究较为深入。目前已知IFN-α2b对毛细胞白血病、慢性髓性白血病、肾癌,非何杰金淋巴瘤、恶性黑色素瘤等有肯定的疗效。IFN对其它肿瘤的疗效也正在研究中。近年来,我院用美国Schering公司提供的IFN-α2b(Intron A)治疗27例晚期肿瘤病人,现将初步临床观察结果报告如下。临床资料及给药方法 1986年5月～1989年3月共收治经病理证实的晚期肿瘤病人27例。

干扰素-α2b对慢性髓系白血病抗血管生成作用的体外研究

本研究旨在应用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及K562细胞探讨干扰素-α2b在慢性髓系白血病(CML)中抗血管生成作用。用ELISA法检测K562细胞系培养上清液中VEGF和bFGF水平;应用real-time RT-PCR法检测103、102、10U/ml IFN-α2b作用K562细胞24、36、48小时VEGF、bFGF mRNA的表达;通过MTT法、Transwell室及体外微管形成实验研究K562细胞培养上清液及IFN-α2b对HUVEC增殖、迁移及体外分化的影响。结果表明:K562细胞系表达和分泌VEGF和bFGF,细胞培养上清液能明显促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,其作用随着细胞培养上清液浓度的增加而增强;IFN-α10U/ml作用K562细胞24、36、48小时,VEGF相对表达量为1.64±0.18、1.49±0.14、1.31±0.05,bFGF相对表达量分别为1.53±0.10、1.29±0.15、0.79±0.13(p=0.002),随着药物浓度增高,细胞VEGF、bFGF相对表达量无明显差异。结论:CML存在血管新生,K562细胞分泌和表达促血管新生因子VEGF和bFGF,促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,干扰素通过抑制HUVEC的增殖、迁移、微管形成,下调K562细胞VEGF和bFGF mRNA表达,具有一定程度的抗血管新生作用。

聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化和制备

目的 建立聚乙二醇修饰干扰素 α2 b的分离纯化方法。方法 运用 Superdex75 Highload制备型凝胶色谱柱 ,以含 0 .1 5 mol/L Na Cl的 0 .0 1 mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱 ,流速为 1 .5 ml/min,检测波长为 2 1 5nm。结果 各洗脱组分经 SDS-PAGE检测呈单一条带。聚乙二醇修饰干扰素 α2 b的蛋白回收率为 3 6.5 % ,抗病毒活性回收率为 4 .3 % ,比活度为 4 .74× 1 0 7IU/mg,是原形干扰素 α2 b的 1 0 .4 %。结论 这种方法可以用于制备聚乙二醇修饰干扰素α2

基因工程人干扰素α2b和α2a亚型抗病毒效应的实验研究

本文采用鸡胚接种法和微量细胞病变抑制法研究了不同亚型α干扰素（α２ａＩＦＮ和α２ｂＩＦＮ）抗流感病毒、脊髓灰质炎病毒以及麻疹病毒的作用。结果表明：两种亚型α干扰素均显示明显的抗病毒效应，其中（１）α２ｂＩＦＮ抗流感病毒作用略强于α２ａＩＦＮ，（２）两亚型α干扰素抗脊髓灰质炎和麻疹病毒作用相似。