为表达重组牛干扰素ω12(rBoIFN-ω12),并分析该蛋白的稳定性和免疫调节机制,本研究首先从牛的肝脏基因组中扩增牛IFN-ω12基因,构建克隆载体,从克隆载体中扩增牛IFN-ω12成熟肽编码基因,并将其克隆于p ET-32a载体构建了重组表达载体p E...为表达重组牛干扰素ω12(rBoIFN-ω12),并分析该蛋白的稳定性和免疫调节机制,本研究首先从牛的肝脏基因组中扩增牛IFN-ω12基因,构建克隆载体,从克隆载体中扩增牛IFN-ω12成熟肽编码基因,并将其克隆于p ET-32a载体构建了重组表达载体p ET-32a-Bo IFNω12,经酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌诱导表达重组蛋白r Bo IFNω12。在不同细胞系中检测纯化后r Bo IFNω12蛋白的生物学活性,结果显示r Bo IFNω12在MDBK和PK-15细胞中对水泡性口炎病毒(VSV)具有抗病毒活性;此外,40μg/m L的r Bo IFNω12在MDBK细胞中相对r Bo IFNαA有较低细胞毒性。经酸碱或高温处理后,r Bo IFNω12仍具有抗病毒活性。通过双荧光素酶试验在牛肺细胞(BL)中检测r Bo IFNω12蛋白对IFN信号通路中关键元件的影响,结果显示与未加r Bo IFN-ω12的对照细胞相比,r Bo IFNω12能够有效激活NF-κB响应元件、ISRE结合元件和Bo IFN-β启动子调控的荧光素酶活性。通过荧光定量PCR和western blot检测r Bo IFNω12作用MDBK细胞后不同时间IFN刺激因子(ISG)的表达情况,结果显示r Bo IFNω12作用MDBK细胞后,细胞中ISG15、ISG56、Mx-1的m RNA转录水平及表达量在3 h~24 h逐渐增多,Mx-1蛋白表达量在6 h~24 h比未处理组增多。本研究表明牛IFN-ω12具有抗病毒和抗细胞增殖活性,细胞毒性较低,可刺激细胞中NF-κB下游ISG中的Mx1、ISG15、ISG56的表达,并能启动细胞中NF-κB、ISRE、Bo IFN-β启动子激活的荧光素酶活性,具有典型I型IFN的特征,可作为有效的抗病毒药物,为牛IFN-ω系统的进一步研究提供思路。展开更多
文摘为表达重组牛干扰素ω12(rBoIFN-ω12),并分析该蛋白的稳定性和免疫调节机制,本研究首先从牛的肝脏基因组中扩增牛IFN-ω12基因,构建克隆载体,从克隆载体中扩增牛IFN-ω12成熟肽编码基因,并将其克隆于p ET-32a载体构建了重组表达载体p ET-32a-Bo IFNω12,经酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌诱导表达重组蛋白r Bo IFNω12。在不同细胞系中检测纯化后r Bo IFNω12蛋白的生物学活性,结果显示r Bo IFNω12在MDBK和PK-15细胞中对水泡性口炎病毒(VSV)具有抗病毒活性;此外,40μg/m L的r Bo IFNω12在MDBK细胞中相对r Bo IFNαA有较低细胞毒性。经酸碱或高温处理后,r Bo IFNω12仍具有抗病毒活性。通过双荧光素酶试验在牛肺细胞(BL)中检测r Bo IFNω12蛋白对IFN信号通路中关键元件的影响,结果显示与未加r Bo IFN-ω12的对照细胞相比,r Bo IFNω12能够有效激活NF-κB响应元件、ISRE结合元件和Bo IFN-β启动子调控的荧光素酶活性。通过荧光定量PCR和western blot检测r Bo IFNω12作用MDBK细胞后不同时间IFN刺激因子(ISG)的表达情况,结果显示r Bo IFNω12作用MDBK细胞后,细胞中ISG15、ISG56、Mx-1的m RNA转录水平及表达量在3 h~24 h逐渐增多,Mx-1蛋白表达量在6 h~24 h比未处理组增多。本研究表明牛IFN-ω12具有抗病毒和抗细胞增殖活性,细胞毒性较低,可刺激细胞中NF-κB下游ISG中的Mx1、ISG15、ISG56的表达,并能启动细胞中NF-κB、ISRE、Bo IFN-β启动子激活的荧光素酶活性,具有典型I型IFN的特征,可作为有效的抗病毒药物,为牛IFN-ω系统的进一步研究提供思路。
