干扰素诱导蛋白Nmi与IFP35的结合区域及Nmi亚细胞定位

人源N-Myc结合蛋白(N-Myc interactor,Nmi)能在干扰素(interferon,IFN)诱导后高表达,并参与下游的JAK-STAT通路,且有抑制癌细胞增殖的功能.Nmi能够结合人干扰素结合蛋白35(interferon-induced protein 35,IFP35)并保护IFP35不被降解.本研究构建了Nmi和IFP35的全长及N端截短体克隆,通过两种蛋白的共表达和GST pull down实验确定二者能够相互作用的区域,并进一步大量共表达和纯化了重组蛋白复合物.结合实验表明,与先前报道的两者通过C端串联的NID结构域相结合不同,两者的N端结构域都足以介导复合物形成.免疫荧光观察未经干扰素刺激的RAW264.7细胞,发现Nmi与IFP35共定位于细胞核内.免疫荧光观察Nmi在293A细胞中的分布特点,发现正常细胞中Nmi分布于细胞核内.如先前研究报道,干扰素诱导24h后,Nmi在胞质内形成颗粒状聚集,此时加入低浓度过氧化氢(H2O2)会使Nmi的亚细胞定位回到细胞核内,表明Nmi的亚细胞定位受到细胞氧化环境的影响.

干扰素刺激应答元件介导IFN-α-2b对IFP35的转录调控

IFP35为分子量35 kDa的干扰素诱导蛋白,可以被Ⅰ型干扰素诱导表达,但是其受干扰素调控机制未知.为了阐明Ⅰ型干扰素对IFP35的转录调控机制,克隆了IFP35基因翻译起始点上游242 bp(-359～-118)的序列,将之置于萤火虫荧光素酶基因上游,构建报告质粒pGL-359,瞬时转染实验证实,该段序列具有启动子活性;序列分析表明其为GC box型启动子,-181～-170 bp序列符合干扰素刺激应答元件(interferon stimulate response element,ISRE)特征.用IFN-α-2b处理细胞后,pGL-359活性可提高达3.1倍,但突变pGL-359上的ISRE特征序列后,该突变启动子不再响应IFN-α-2b刺激.随后的凝胶电泳阻滞实验发现,用IFN-α-2b处理HeLa细胞后,其核蛋白可与IFP35启动子上的ISRE元件形成明显的阻滞带,表明ISRE介导了IFN-α-2b对IFP35的转录调控.