莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

IFT139是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纤毛内运输蛋白IFT复合物A中的一个重要组分.其编码基因的突变、缺失或沉默将会影响纤毛正常的组装和解聚,进而导致纤毛病的产生.为深入研究IFT139的作用机制,本实验首先PCR获得ift139 5′端458 bp的EST片断,成功构建了p MAL-c2-ift139与p ET-28a(+)-ift139重组质粒.然后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,分别得到相对分子质量为6.0×104和2.5×104的重组MBP/HIS-IFT139融合蛋白.进一步将亲和纯化的MBP-IFT139融合蛋白(纯度95%,以上),免疫新西兰大白兔获得抗血清,间接ELISA法测得血清效价为1﹕256,000.最后将抗血清依次经Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blot检测抗体特异性,结果显示所制备抗体能够正确特异性识别莱茵衣藻中的IFT139,从而为IFT139作用机制的阐明和纤毛相关疾病的研究奠定了重要基础.