基于IGF-1/PI3K/AKT/mTOR信号通路的归脾汤对化疗肌少症的调节作用探讨

目的探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的肌少症的发生机制是否与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路有关,并用归脾汤进行调节。方法选取40只SPF级雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组(28mg/kg 5-FU)、归脾汤低剂量组(28mg/kg 5-FU+0.5g/ml归脾汤)、中剂量组(28mg/kg 5-FU+1g/ml归脾汤)、高剂量组(28mg/kg 5-FU+2g/ml归脾汤),每组8只,造模的同时归脾汤组灌胃不同剂量归脾汤,连续干预14天。末次给药后,大鼠禁水禁食,次日处死大鼠,取腓肠肌等以待检测,期间记录各组大鼠体重、抓力等生理状况。苏木素-伊红(HE)染色观察各组大鼠腓肠肌组织病理改变;免疫组织化学法(IHC)检测腓肠肌组织中肌萎缩相关蛋白Fbxo32及Trim63蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腓肠肌组织内胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的含量;实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定腓肠肌组织中IGF-1、IGF-1R的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测腓肠肌组织中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达水平。结果与空白组相比,模型组大鼠体质量、抓力均明显下降(P<0.01);肌细胞间隙增大、细胞核紊乱出现核内移,并可见炎性细胞浸润;IGF-1、IGF-1R蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.01);Fbxo32、Trim63蛋白表达明显升高(P<0.01);p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平的比值显著降低(P<0.01)。与模型组相比,归脾汤低、中、高剂量大鼠体质量、抓力上升(P<0.05,P<0.01);腓肠肌内IGF-1、IGF-1R蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05,P<0.01);Fbxo32、Trim63蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01);p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平的比值显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论归脾汤对5-FU诱导的肌少症模型大鼠具有明显改善作用,可能与激活IGF-1/PI3K/AKT/mTOR信号通路,上调IGF-1、IGF-1R、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达有关。

DCLK1激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进A549细胞的恶性行为

目的探讨双肾上腺素皮质样激酶1(DCLK1)对A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响,并探究可能涉及的相关分子机制。方法慢病毒感染法建立稳定表达DCLK1分子的A549细胞系,反转录-聚合酶链技术和蛋白质印记法进行鉴定。CCK-8与平板克隆实验检测过表达DCLK1后细胞增殖能力变化。Transwell实验观察过表达DCLK1对细胞迁移与侵袭能力的影响。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析DCLK1对肺腺癌细胞的调控富集通路,蛋白质印记法进行验证。结果DCLK1在A549细胞中过表达可增加细胞的增殖、迁移与侵袭等能力,而抑制FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路可削弱DCLK1对A549细胞的恶性调控。结论DCLK1通过激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进A549细胞的恶性生物学行为。

1-磷酸鞘氨醇受体2通过AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_(25-35)诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关的认知功能下降的神经退行性疾病。1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)参与多种细胞过程,被证实在神经系统发育中发挥重要作用。本文旨在探究S1PR2对Aβ_(25-35)诱导的AD细胞模型损伤的作用及可能机制。研究通过Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞构建细胞损伤模型,并且构建靶向S1PR2的干扰序列用于干预细胞中S1PR2的表达。Western印迹及RT-PCR检测S1PR2蛋白及基因表达,发现Aβ_(25-35)诱导的细胞模型中S1PR2蛋白及基因表达均显著增加(P<0.01),S1PR2干预后模型组内S1PR2蛋白及基因表达显著降低(P<0.001)。CCK8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,S1PR2干预后显著增加Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞的增殖活性,减少细胞凋亡(P<0.01)。Western印迹检测细胞中APP、Tau、p-Tau和PSD95的表达,结果显示,S1PR2干预后显著降低模型组细胞内APP、Tau和p-Tau的表达,增加突触蛋白PSD95的表达,可显著改善Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤(P<0.001)。另外,试剂盒检测细胞中ATP的产生,流式细胞术检测ROS含量及线粒体膜电位以分析细胞的线粒体功能,结果显示,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞显著降低了细胞中ATP的产生,增加了ROS含量,减少了线粒体膜电位(P<0.001)。S1PR2干预后显著增加Aβ_(25-35)诱导的细胞模型中ATP的产生,降低ROS含量,增加线粒体膜电位(P<0.001)。最后,通过Western印迹检测AKT/mTOR通路蛋白质表达,结果显示,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞促进了p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的表达,S1PR2干预后显著抑制AKT/mTOR通路的激活(P<0.001)。总而言之,S1PR2可能通过促进AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤进程。

LncRNA MALAT1对PCOS颗粒细胞凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR通路的影响

目的探讨长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录子1(LncRNA MALAT1)对多囊卵巢综合征(PCOS)颗粒细胞的凋亡、自噬和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的影响。方法qRT-PCR检测PCOS卵巢组织、正常卵巢组织、人卵巢颗粒细胞KGN及正常卵巢上皮细胞IOSE80中LncRNA MALAT1的表达水平。体外培养KGN细胞,将KGN细胞分为control组、si-NC组、si-MALAT1组、pc-NC组、pc-MALAT1组、pc-MALAT1+740Y-P(PI3K激活剂)组。q RT-PCR检测各转染组细胞MALAT1 mRNA的表达水平;CCK-8检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;透射电镜观察KGN细胞中自噬小体;Western blot检测细胞B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、微管相关蛋白Ⅱ轻链3(LC3Ⅱ)、微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3Ⅰ)、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。结果PCOS卵巢组织MALAT1 mRNA表达水平低于正常卵巢组织,KGN细胞中MALAT1 mRNA表达水平低于正常卵巢上皮IOSE80细胞;control组KGN细胞中可见少量的自噬小体;干扰MALAT1表达后KGN细胞OD_(450)值(24、48、72 h)、Bcl-2蛋白表达降低,细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高(P<0.05),自噬小体数量增多;过表达MALAT1后上述指标变化均逆转(P<0.05);与pc-MALAT1组相比,pc-MALAT1+740Y-P组OD_(450)(24、48、72 h)值、Bcl-2蛋白表达降低,凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05),自噬小体数量增多。结论过表达MALAT1可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而抑制PCOS颗粒细胞凋亡和自噬。

木犀草素通过增加ROS的产生和下调AKT/mTOR通路及HO-1蛋白表达抑制肺癌A549细胞增殖

目的探究木犀草素(Lut)对肺癌A549细胞增殖的抑制作用及其内在机制。方法用不同浓度的Lut处理A549细胞48 h,通过MTT法检测细胞活性,通过平板克隆和EdU染色检测细胞增殖,通过DCFH-DA法检测细胞活性氧(ROS)水平,通过Hoechst33258染色法检测细胞凋亡水平,通过MDC染色法检测细胞自噬水平,通过Western blotting实验检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9,自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、P62,AKT/mTOR通路蛋白以及HO-1蛋白的表达。结果Lut剂量依赖性的抑制A549细胞的活力和增殖能力(P<0.05),引发细胞内ROS水平增加(P<0.05),上调凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-9和自噬相关蛋白Beclin1的表达,增加LC3B-II/LC3B-I的比值,下调抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬相关蛋白P62的表达,诱导细胞凋亡和自噬(P<0.001)。此外,Lut可显著抑制AKT和mTOR的磷酸化,下调HO-1蛋白的表达(P<0.05)。结论Lut通过增加细胞内ROS的产生,抑制AKT/mTOR通路以及下调HO-1蛋白水平诱导A549细胞的凋亡和自噬。

IGF-1对Rh1肉瘤细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的探讨胰岛素样生长因子(IGF)1对Rh1肉瘤细胞生长活性和PI3K/Akt/mTOR信号通路的背景变化。方法常规细胞培养,用无血清培养基消除内源性因子影响27 h,再用IGF-1(终浓度为10 ng/ml)刺激72 h,流式细胞仪检测细胞生长活性;另外Western印迹方法观察IGF-1刺激细胞5、10、20、30和60 min后Akt(s473)、S6的动态变化。结果与对照组相比,IGF-1可促进Rh1细胞存活。IGF-1刺激不同时间后S6磷酸化则随着时间的延长逐渐增强;IGF-1亦导致Akt(s473)位点的磷酸化,随时间的延长,磷酸化Akt在5 min时达高峰,此后逐渐减弱。结论Akt、S6等是PI3K/Akt/mTOR信号通路中的重要信号分子,对Rh1细胞而言,在IGF-1刺激下S6有逐渐增强的变化,Akt(s473)位点磷酸化则有减弱的动态变化。

lncRNA NEAT1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节自噬影响膜性肾病的进展

目的 探讨长链非编码RNA核富集转录本1(lncRNA NEAT1)对膜性肾病(MN)中自噬的影响及其机制。方法 利用白蛋白诱导HK-2细胞构建体外MN模型,将HK-2细胞分为5组:对照组、模型组、LY294002(PI3K抑制剂)组、OV-NEAT1(NEAT1过表达)组和OV-NEAT1+LY294002组。CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,qRT-PCR和Western blot检测自噬和PI3K/Akt/mTOR通路相关mRNA和蛋白的表达水平。结果 与对照组相比,模型组细胞增殖能力及细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(均P<0.01),细胞凋亡率及细胞中LC3-Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR mRNA和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高(均P<0.01);与模型组相比,OV-NEAT1组细胞增殖能力、细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA和LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率及细胞中LC3-Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR mRNA和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高(均P<0.01),LY294002组趋势相反;与LY294002组相比,OV-NEAT1+LY294002组细胞增殖能力及细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA和LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率及细胞中LC3-Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR mRNA和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。结论lncRNA NEAT1能够抑制白蛋白诱导的HK-2细胞的自噬,其机制可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活有关。

PI3K/AKT/mTOR信号通路在膀胱癌中的作用

目的:分析磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路在膀胱癌中的作用。方法:选取60只SD健康雄性大鼠,采用随机数字法分为对照组、模型组和干预组,每组各20只。模型组和干预组大鼠以致癌物BBN灌胃8周建立膀胱癌模型,建模成功后,干预组大鼠注射PI3K抑制剂,连续干预6周。观察三组大鼠膀胱组织病理学变化,比较各组大鼠血清炎性因子指标、氧化应激指标、PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达和CK-19、CYFRA21-1水平的变化。结果:与对照组相比,模型组和干预组大鼠血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、C反应蛋白(CRP)、丙二醛、一氧化氮、PI3K、AKT、mTOR蛋白表达量、CK-19、CYFRA21-1水平升高,总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)水平降低(P<0.05)。与模型组相比,干预组血清TGF-β1、IL-1β、CRP、丙二醛、一氧化氮、PI3K、AKT、mTOR蛋白表达量、CK-19、CYFRA21-1水平均降低,T-AOC、SOD水平升高(P<0.05)。结论:PI3K抑制剂通过PI3K/AKT/mTOR信号通路遏制膀胱癌的发展。

糖尿病小鼠肾组织中Notch1通过Akt/mTOR通路抑制自噬促进肾小管间质纤维化

目的:观察糖尿病小鼠肾脏组织中Notch1蛋白表达和自噬水平的变化对肾脏纤维化的影响,探讨糖尿病肾病中Notch1通过抑制自噬对肾小管间质纤维化的调控机制。方法:取db/m小鼠(正常对照组)和db/db小鼠(糖尿病组),每组各8只。饲养12周后处死小鼠,测定相应生化指标,免疫组化观察肾小管上皮细胞Notch1蛋白的表达部位,Western blot法检测小鼠肾组织Notch1、PTEN、p-Akt(Thr308)、Akt、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、LC3、P62、Ⅰ型胶原(Col-I)和Ⅲ型胶原(Col-III)的蛋白水平变化。结果:与db/m小鼠比较,db/db小鼠的血糖、糖化血红蛋白、血肌酐、甘油三酯和总胆固醇明显增高(P<0.01);HE染色可见db/db小鼠的肾小管上皮细胞出现空泡样变性,间质中炎性细胞浸润,肾小管扩张;Masson染色可见db/db小鼠的肾脏组织中有大量胶原纤维样物质沉积于肾小球毛细血管腔内和肾间质,肾小管结构排列紊乱。Western blot结果显示db/db小鼠的肾组织中Notch1、P62、p-mTOR(Ser2448)、p-Akt(Thr308)、Col-I和Col-III的蛋白水平明显增加(P<0.01),PTEN的蛋白表达显著降低(P<0.01),LC3-Ⅱ的蛋白表达减少(P<0.05),总的mTOR和Akt蛋白水平的差异无统计学显著性。结论:糖尿病db/db小鼠肾脏组织中的Notch1蛋白表达增加,PTEN蛋白表达减少,Akt/mTOR通路活性升高,自噬受到抑制,这些变化促进了肾脏纤维化病变发生发展。

2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路的改变及Sirt1的调控机制研究

目的检测Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白在糖尿病大鼠心肌及高糖培养的H9C2细胞中的表达变化,明确其在糖尿病心肌病发生发展中的作用。方法高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,实验将大鼠分为糖尿病2周、4周、8周模型组和对照组,超声心动图检测大鼠心功能变化,Western blot检测大鼠心肌Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1蛋白表达变化。将H9C2细胞分为正常对照组、DMSO组(78.12 mmol·L^(-1))、高糖(HG)组(33 mmol·L^(-1))、白藜芦醇(Res)组(20μmol·L^(-1))、尼克酰胺(Nam)组(40 mmol·L^(-1)),Western blot及qRT-PCR研究心肌细胞Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1相关蛋白基因转录及表达,研究Sirt1对该信号通路的调控机制。结果在动物实验中,与2周DM大鼠比较,8周DM大鼠心肌Sirt1蛋白表达明显增加。2周模型组大鼠相对于正常对照组心肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1表达明显增加,且S6K1表达4周模型组比2周模型组增加更明显,但8周表达降低。在高糖培养的H9C2细胞中,与对照组相比,高糖组Sirt1,PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达明显增高。Nam处理组Sirt1表达明显降低,PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达增高。Res处理组Sirt1表达明显增高,而PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达降低。结论 Sirt1通过负调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与糖尿病心肌损伤,参与早期糖尿病心肌病的发生发展。

细胞角蛋白13通过PTEN抑制PI3K/AKT/mTOR通路增强鼻咽癌HNE1细胞放疗敏感性

目的:探讨细胞角蛋白13(cytokeratin 13,CK13)对鼻咽癌HNE1细胞放疗敏感性的影响及其作用机制。方法:将HNE1细胞分为对照组、anti-CK13#a组及anti-CK13#b组(敲减CK13)、对照组+西罗莫司处理组(100 nmol/L的西罗莫司处理1 h)、anti-CK13#a+西罗莫司处理组(100 nmol/L的西罗莫司处理1 h),经放疗处理(200 c Gy/min剂量照射5 min)后,用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力,用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,q PCR法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因PTEN的表达,WB法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:经放疗处理后,与对照组相比,敲减CK13后HNE1细胞增殖能力明显增强(P<0.01),细胞凋亡率明显降低(P<0.01);细胞中c-caspase-3和γH2AX的表达明显降低(均P<0.01)、p-AKT和p-S6K表达明显升高(P<0.01)、PTEN蛋白表达明显降低(P<0.01)。敲减CK13+西罗莫司(PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂)处理可以回复敲减CK13导致的细胞增殖能力增强(P<0.05)和细胞凋亡率降低(P<0.01)。结论:敲减CK13通过下调PTEN蛋白水平进而增强PI3K/AKT/mTOR信号通路活性,最终降低HNE1细胞的放疗敏感性。

芹菜素对人肺癌H1975细胞增殖、凋亡、转移及IGF-1R/Akt信号通路的影响

目的:探讨芹菜素对人肺癌H1975细胞增殖、凋亡和转移及胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法:设H1975细胞组、氟尿嘧啶组(100μg·ml-1)、芹菜素低(100μg·ml-1)、高(200μg·ml-1)剂量组,以上各组每孔设6个平行样,培养72h。MTT法、结晶紫染色测定细胞增殖、克隆形成数目,Transwell细胞培养室评估细胞迁移,流式细胞仪测定凋亡水平,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及蛋白免疫印迹(WEST-BLOT)法检测IGF-1R、Akt基因和蛋白表达水平。结果:与H1975细胞组比较,氟尿嘧啶组、芹菜素低、高剂量组的光密度(OD)值、存活率、细胞克隆形成数目、穿膜数、IGF-1R、Akt mRNA和蛋白降低,凋亡率升高(P<0.05)。与氟尿嘧啶组比较,芹菜素低剂量组的光密度(OD)值、存活率、细胞克隆形成数目、穿膜数、IGF-1R、Akt mRNA和蛋白升高,凋亡率降低(P<0.05);芹菜素高剂量组OD值、存活率、细胞克隆形成数目、穿膜数、IGF-1R、Akt mRNA和蛋白降低,凋亡率升高(P<0.05)。与芹菜素低剂量组比较,芹菜素高剂量组的OD值、存活率、细胞克隆形成数目、穿膜数、IGF-1R、Akt mRNA和蛋白降低,凋亡率升高(P<0.05)。结论:芹菜素能明显抑制人肺癌H1975细胞增殖、凋亡和转移;其机制与芹菜素抑制IGF-1R、Akt mRNA和蛋白的表达,进而抑制了IGF-1R/Akt信号通路的激活有关。

基于Notch/Hes1和PI3K/AKT/mTOR信号通路研究蜈蚣败毒饮对银屑病小鼠的治疗作用及机制

目的:基于Notch/Hes1和PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨蜈蚣败毒饮治疗银屑病模型小鼠的作用机制。方法:采用脱毛区域涂抹咪喹莫特诱导建立银屑病小鼠模型,将成模小鼠按随机数字表分为模型组、甲氨蝶呤(2.2 mg/kg)阳性对照组及蜈蚣败毒饮低(30 g/kg)、中(60 g/kg)、高(120 g/kg)剂量组,以脱毛区域涂抹凡士林的10只小鼠作为正常对照组。灌胃给药,正常对照组和模型组小鼠灌胃相应体积纯水。除甲氨蝶呤组小鼠前4 d每天灌胃甲氨蝶呤,后4 d每天灌胃相应体积纯水外,其余各组均连续灌胃8 d。采用皮损严重程度指数(PASI)评估各组小鼠银屑病严重程度,采用酶联免疫法测定治疗后各组小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17a、IL-23a水平,采用qRT-PCR法和Western Blot法检测各组小鼠皮损部位Notch/Hes1及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因和蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠PASI评分、血清炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17a、IL-23a)水平显著升高,损伤皮肤组织Notch-1、Notch-2、Jagged-1、Hes1、AKT、PI3K、mTOR mRNA及蛋白和p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组小鼠PASI评分、血清炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17a、IL-23a)水平显著降低,损伤皮肤组织Notch-1、Notch-2、Jagged-1、Hes1、AKT、PI3K、mTOR mRNA及蛋白和p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:蜈蚣败毒饮对银屑病具有较好的治疗作用,可显著降低银屑病小鼠血清炎症因子水平,并能抑制Notch/Hes1和PI3K/AKT/mTOR信号通路。

补肾活血汤通过调控PI3K/Akt/mTOR通路对HEI-OC1细胞的抗衰老作用

目的探讨补肾活血汤延缓耳蜗毛细胞株HEI-OC1衰老的潜在机制。方法应用D-半乳糖建立衰老HEI-OC1细胞模型,设立对照组、模型组、补肾活血汤组、PI3K抑制剂组和补肾活血汤+PI3K抑制剂组。采用ELISA法检测细胞SOD、GSH-Px活性和MDA水平,DCFH-DA法检测细胞ROS水平,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞Beclin-1、P62、Bcl-2、Bax mRNA表达。结果与对照组比较,模型组HEI-OC1细胞SOD和GSH-Px活性、ROS水平、Beclin-1和Bcl-2 mRNA表达均降低(P<0.01),MDA水平、细胞凋亡率、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达、P62和Bax mRNA表达均升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组均可改善以上指标(P<0.05,P<0.01),其中补肾活血汤+PI3K抑制剂组作用最为显著,而补肾活血汤组与PI3K抑制剂组之间比较无差异。结论补肾活血汤可通过促进自噬、抑制凋亡和减轻氧化应激损伤延缓HEI-OC1细胞的衰老,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

蛇床子素通过PI3K/Akt/mTOR通路对糖尿病肾病大鼠纤维化及HSP90、SIRT1的影响

目的 研究蛇床子素对糖尿病肾病大鼠磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)信号通路对及热休克蛋白(Hsp)90、沉默信息调节因子(SIRT)1的影响。方法 将糖尿病肾病模型大鼠随机分为5组:模型组和灌胃蛇床子素1、10、20和50 mg/(kg·d)组,正常组和模型组分别给予相同体积的生理盐水。于给药8 w后,测定大鼠血糖变化和24 h尿微量白蛋白;取血检测大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN),并计算肌酐清除率(Ccr)。采用RT-聚合酶链反应(PCR)检测大鼠肾脏组织SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA及蛋白表达情况;观察大鼠肾脏组织病理变化;采用Western印迹法测定纤维化相关蛋白:肾脏Ⅳ型胶原蛋白、纤联蛋白(FN)和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(TIMP)-1、MMP-9及PI3K、Akt蛋白表达。结果 模型组血糖、尿微量白蛋白、Scr、BUN、PI3K、Akt、肾脏Ⅳ型胶原蛋白、FN和TIMP-1水平均显著高于正常组(P<0.05),Ccr、SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白、MMP-9水平显著低于正常组(P<0.05)。与模型组相比,治疗组Scr和BUN水平均降低,Ccr水平均增加,当剂量达到20和50 mg/(kg·d)时,差异显著(P<0.05)。与模型组相比,治疗组PI3K和Akt水平均降低,且具有剂量依赖性,剂量达到10、20、50 mg/(kg·d)时,PI3K明显降低(P<0.05);剂量达到1、10、20、50 mg/(kg·d),Akt明显降低(P<0.05)。各治疗组与模型组相比,SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白、MMP-9表达水平均显著增加,肾脏Ⅳ型胶原蛋白、FN、TIMP-1水平、血糖及尿微量白蛋白均显著降低(P<0.05);各组Hsp90α和Hsp90β mRNA及Hsp90α和Hsp90β蛋白表达水平均无显著差异(P>0.05)。与正常组相比模型组肾小球肥大,肾小球数量增加,伴有肾小球系膜扩张和基底膜厚度增加,肾小管有空泡变形。治疗组肾小球肥大、增生及系膜扩张和基底膜变后现象均较轻,其中高剂量治疗组改善最显著。结论 蛇床子素可以降低糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白,降低肾组织病理损伤,可能与PI3K/Akt/mTOR通路有关,且可以上调SIRT1表达水平,降低肾纤维化,对HSP90表达水平无明显关系。

SDC1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响肝细胞性肝癌自噬机制的研究

目的探究SDC1和PI3K/Akt/mTOR信号通路在肝细胞性肝癌(HCC)中的相对表达情况,并进一步探讨其与细胞自噬的关系。方法收集2010年5月至2015年9月安徽医科大学第二附属医院肝胆外科50份肝细胞癌手术切除的HCC组织(HCC组)和50份癌旁正常肝组织(癌旁组),应用RT-PCR和Western Blot技术分别检测两组的SDC1、PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3ⅠmRNA和蛋白的相对表达水平,并分析SDC1基因与HCC预后的关系。结果HCC组的SDC1、PI3K、Akt、mTOR mRNA相对表达量高于癌旁组,Beclin-1、LC3ⅠmRNA相对表达量低于癌旁组,差异具有统计学意义(P<0.05)。HCC组的SDC1、PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量高于癌旁组,Beclin-1、LC3Ⅰ蛋白相对表达量低于癌旁组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示,SDC1高表达组患者的5年总体生存率为40.00%,低于低表达组患者的56.00%(P<0.05)。结论SDC1和PI3K/Akt/mTOR信号通路在HCC中异常表达,SDC1有可能成为筛选、诊断和评估HCC预后的标志性分子,且可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制细胞自噬行为。

胡桃醌调控ANXA2和ERCC1表达通过AKT/mTOR信号通路

目的 研究胡桃醌调控ANXA2和ERCC1表达通过AKT/mTOR信号通路逆转胃癌细胞顺铂耐药影响。方法 将人胃癌/顺铂耐药细胞株BGC-823/DDP随机分为3组:正常对照组(Control)、顺铂组(10μM DDP处理)、胡桃醌联合顺铂组(10μM DDP联合胡桃醌4.5μM、9μM、18μM处理)。经过Western blot实验检测细胞中细胞凋亡相关蛋白ANXA2、ERCC1蛋白相对表达水平。结果 与对照组比较,10μM DDP组BGC-823/DDP细胞中ANXA2、ERCC1蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05);与10μM DDP组比较,胡桃醌不同浓度处理组BGC-823/DDP细胞中ANXA2、ERCC1蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05);且9μM Juglone+10μM DDP和18μM Juglone+10μM DDP组BGC-823/DDP细胞中ANXA2、ERCC1蛋白相对表达水平明显降低4.5μM Juglone+10μM DDP组(P<0.05)。 结论 胡桃醌抑制ANXA2和ERCC1表达,并通过AKT/mTOR信号通路逆转胃癌顺铂耐药细胞对顺铂的耐药性。

抑制mTOR信号通路对幼鼠肺损伤时p-AKT1分子的影响及意义

目的:探讨抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在高体积分数氧(高氧)致SD幼鼠肺损伤时对磷酸化AKT1(p-AKT1)分子的影响和意义。方法:72只SD幼鼠(3周龄)随机分为空气+生理盐水组、高氧+生理盐水组、高氧+OSI-027组及高氧+雷帕霉素组(n=18),分别构建动物模型。高氧选择90%氧气持续干预,生理盐水、OSI-027和雷帕霉素干预分别在观察期第1、3、6、8、10和13天时经腹腔注射给药。在造模第3、7和14天时取各组幼鼠进行体重测量、肺湿干重比(wet/drg weight ratio,W/D)计算、肺组织病理学检查、肺泡间隔宽度测定和肺损伤评分,肺组织免疫组化和Western blot检测磷酸化S6K1(p-S6K1)和p-AKT1的分布与水平。结果:与空气组比较,高氧组幼鼠体重明显下降(P<0.05),肺损伤急性期肺W/D增高(P<0.05),肺泡间隔宽度及肺损伤评分明显增加(P<0.05),肺组织p-S6K1阳性细胞增多(P<0.05),肺组织p-AKT1阳性细胞减少(P<0.05),p-S6K1蛋白显著升高(P<0.01),p-AKT1蛋白明显减低(P<0.01);与高氧组比较,高氧+OSI-027组的肺组织损伤减轻,肺组织p-S6K1阳性细胞减少(P<0.05),p-AKT1阳性细胞增多(P<0.05),p-S6K1蛋白水平显著降低(P<0.05),p-AKT1蛋白水平增加(P<0.05);高氧+雷帕霉素组的肺损伤进一步加重(P<0.05),p-S6K1阳性细胞减少(P<0.05),p-AKT1阳性细胞增加(P<0.05),p-S6K1蛋白水平显著降低(P<0.05),p-AKT1蛋白水平显著增加(P<0.05)。与高氧+雷帕霉素组比较,高氧+OSI-027组的肺组织损伤减轻(P<0.05),肺组织p-AKT1阳性细胞减少(P<0.05),p-AKT1蛋白水平降低(P<0.05)。结论:p-AKT1参与了高氧肺损伤的发生发展,其调控机制可能与抑制mTOR信号通路的活化有关。高氧肺损伤时,p-AKT1蛋白水平下降,mTOR抑制剂能增加p-AKT1蛋白水平,但只有mTORC1/2双重抑制剂OSI-027能减轻高氧所致SD幼鼠的肺损伤及纤维化。

基于IGF-1R/Akt/PGC-1α通路探讨芍药苷对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用

目的研究芍药苷(Paeoniflorin,PF)对过氧化氢(H2O2)诱导高分化大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)氧化损伤模型的保护作用及其机制。方法采用无血清H2O2体外诱导PC12细胞氧化损伤,并以不同浓度PF(100、200、300μmol·L-1)进行干预。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;倒置生物显微镜观察细胞形态;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC);Western Blot法检测胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(PGC-1α)蛋白的表达水平。结果选择8μmol·L-1 H2O2作为模型复制浓度。与正常组比较,H2O2模型组细胞形态异常;细胞存活率明显降低、凋亡率显著升高(P<0.01);MDA含量增高(P<0.01),SOD活力及T-AOC降低(P<0.01);IGF-1R、Akt、pAkt及PGC-1α蛋白表达水平均明显下调(P<0.01)。与模型组比较,PF不同浓度组均能改善细胞形态,显著提高细胞存活率和降低细胞凋亡率(P<0.05,P<0.01);显著提高SOD酶活力和T-AOC(P<0.05,P<0.01),降低MDA含量(P<0.01,200、300μmol·L-1 PF组);明显上调IGF-1R、Akt及PGC-1α蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),提高Akt蛋白的磷酸化(p-Akt)水平(P<0.05,P<0.01)。结论PF可能是通过提高IGF-1R的表达,激活Akt/PGC-1α信号转导通路,增强细胞抗氧化损伤能力,抑制细胞凋亡,从而发挥保护H2O2损伤的PC12细胞的作用。

隔药饼灸对动脉粥样硬化易损斑块兔RhoA/ROCK1信号通路及PI3K、Akt、mTOR表达的影响

目的观察隔药饼灸对动脉粥样硬化(AS)易损斑块兔腹主动脉RhoA/ROCK1信号通路及PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响,探讨其稳定AS易损斑块的作用机制。方法70只雄性新西兰兔随机分为空白组、模型组、隔药饼灸组、直接灸组、西药组和抑制剂组。采用高脂饲料喂养+腹主动脉球囊损伤+基因转染+药物触发斑块破裂制备AS易损斑块模型。各组分别给予相应干预,连续8周。采用ELISA检测血清载脂蛋白A(APO-A)、载脂蛋白B(APO-B)含量,HE染色观察腹主动脉内膜、中膜增生情况并测量内膜、内膜-中膜厚度,免疫组化染色检测Ras同源物基因组成员A(RhoA)、Rho同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)蛋白表达,Western blot检测腹主动脉磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组兔血清APO-A含量显著减少(P<0.01),APO-B含量显著增加(P<0.01),内膜、内膜-中膜厚度增加,腹主动脉RhoA、ROCK1、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,隔药饼灸组兔血清APO-A含量显著增加(P<0.01),APO-B含量显著减少(P<0.01),内膜、内膜-中膜厚度减少,腹主动脉RhoA、ROCK1、Akt、mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05);与直接灸组比较,隔药饼灸组兔血清APO-B含量显著减少(P<0.01);与隔药饼灸组比较,抑制剂组兔腹主动脉PI3K蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论隔药饼灸可能通过抑制RhoA/ROCK1信号通路,降低Akt、mTOR蛋白表达,促进细胞自噬,稳定AS易损斑块。