仑伐替尼通过下调IGF1R/Mek/Erk信号通路治疗瑞戈非尼耐药的肝细胞癌

目的探讨仑伐替尼对瑞戈非尼耐药肝癌细胞的治疗疗效及其作用机制。方法采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)和克隆形成实验观察仑伐替尼对肝癌细胞生长的抑制作用,流式细胞术检测仑伐替尼处理后瑞戈非尼耐药肝细胞癌细胞的凋亡情况,Western blot和免疫组化染色检测相关蛋白表达水平变化,小鼠皮下成瘤实验观察仑伐替尼对瑞戈非尼耐药肝癌细胞体内成瘤能力的抑制效果。结果CCK-8和克隆形成实验显示,仑伐替尼能够抑制肝癌瑞戈非尼耐药细胞的增殖能力;仑伐替尼组HepG2、SMMC7721和瑞戈非尼耐药的HepG2、SMMC7721细胞克隆数[分别为(120.67±11.06)个、(53.00±11.14)个、(55.00±9.54)个和(78.67±14.64)个]均低于对照组[分别为(478.00±24.52)个、(566.00±27.87)个、(333.67±7.02)个和(210.00±12.77)个,均P<0.05]。流式细胞术检测显示,仑伐替尼能够促进肝癌瑞戈非尼耐药细胞凋亡,仑伐替尼组HepG2、SMMC7721和瑞戈非尼耐药的HepG2、SMMC7721细胞凋亡率[分别为(12.30±0.70)%、(9.83±0.38)%、(15.90±1.32)%和(10.60±0.00)%]均高于对照组[分别为(7.50±0.87)%、(5.00±1.21)%、(8.10±1.61)%和(7.05±0.78)%,均P<0.05]。仑伐替尼处理后凋亡相关蛋白比值提示细胞凋亡能力增加。动物实验显示仑伐替尼治疗能够在体内抑制肝癌瑞戈非尼耐药细胞的生长。免疫组化及Western blot结果显示,仑伐替尼能够下调瑞戈非尼耐药细胞中异常活化的IGF1R/Mek/Erk信号通路。结论仑伐替尼能够逆转肝细胞癌瑞戈非尼耐药,其机制可能是通过下调IGF1R/Mek/Erk信号通路实现。

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的:研究在体外条件下多西环素(doxycycline,DOX)对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法:在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下,茜素红染色检测成骨细胞分化;实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响;用DOX、MEK抑制剂(U0126)单独或联合处理MC3T3-E1细胞后,Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果:在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后,其N-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.05),p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加(P<0.05)。而MEK拮抗剂(U0126)则显著上调N-cadherin蛋白表达水平,同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后,DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U0126拮抗。在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,同时存在DOX和U0126时,茜素红染色阳性率低于单独DOX组。结论:DOX可以促进MC3T3-E1细胞株的体外成骨分化;而DOX的这一效应可能是通过MEK-ERK信号通路参与完成的。

Hoxa1通过MEK/ERK信号通路促进低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换的研究

背景 低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH)是一种以血管阻力持续性升高和血管重塑为特征的进展性疾病。研究表明Hoxa1参与血管生成过程,但Hoxa1在调控肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中的作用尚不明确。目的 本研究旨在确定Hoxa1对PASMCs增殖、迁移和表型转化的调控作用。方法 使用Ⅱ型胶原酶消化分离培养原代大鼠PASMCs。采用1%低氧处理细胞构建低氧诱导的细胞模型,并检测24 h、48 h、72 h低氧处理的PASMCs中Hoxa1 mRNA和蛋白表达水平。采用干扰或过表达Hoxa1慢病毒下调或上调细胞中Hoxa1表达。慢病毒干扰实验分为常氧组(Normoxia)、低氧组(Hypoxia)、低氧空病毒组(Hypoxia+shRNA-NC)、低氧Hoxa1干扰病毒组(Hypoxia+shRNA-Hoxa1);慢病毒过表达实验分为对照组(Control)、过表达空病毒组(LV-NC)、过表达Hoxa1组(LV-Hoxa1)。采用EdU检测细胞增殖能力;RT-qPCR检测Hoxa1 mRNA表达;Western blot检测Hoxa1、表型转化标志蛋白、MEK/ERK信号通路蛋白表达;免疫荧光检测Hoxa1、α-actin表达;免疫共沉淀实验确定Hoxa1与MEK的相互作用。结果 成功分离培养PASMCs,并鉴定细胞表达α-SMA。低氧诱导下PASMCs中Hoxa1表达上调(P<0.05)。低氧下Hoxa1沉默抑制PASMCs增殖和迁移,而常氧下Hoxa1过表达促进PASMCs增殖和迁移(P均<0.05)。低氧下沉默Hoxa1导致Hypoxia+shRNA-Hoxa1组收缩型标志蛋白表达升高,合成型标蛋白表达降低(P<0.05)。而在常氧下过表达Hoxa1导致LV-Hoxa1组收缩型标志蛋白降低,合成型标志蛋白升高(P均<0.05)。此外,Hoxa1表达增加促进MEK/ERK信号通路激活。免疫共沉淀结果显示,Hoxa1与MEK存在相互作用。结论 Hoxa1可能通过激活MEK/ERK通路促进PASMCs增殖、迁移和表型转化。

Cyclosporin A通过MEK/ERK1/2信号通路调节滋养细胞titin表达

探讨MEK/ERK1/2信号通路在Cyclosporin A(CsA)诱导滋养细胞表达titin中的作用。应用RT-PCR、Western blot检测CsA诱导的滋养细胞titin的表达水平,Western blot检测CsA作用于滋养细胞后ERK1/2的活化程度,并观察MEK特异性抑制剂U0126对其mRNA转录的影响。发现CsA以时间和剂量依赖方式诱导titin表达,并刺激滋养细胞ERK1/2的活化,U0126以剂量依赖方式抑制CsA诱导的titin表达。结果表明CsA通过活化MEK/ERK1/2信号通路诱导滋养细胞titin 的表达,改变其生物学行为,从而有利于胚胎着床及早期发育。

ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响

目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径。方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20μmol/L组。在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、pERK1/2蛋白表达。结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798)。溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.826、P=0.298)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P=0.001、P=0.002)。溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.370、P=0.351)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P<0.001、P<0.007)。结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达。Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程。

三七皂苷Rg1通过调控MEK5/ERK5信号通路改善血管性痴呆大鼠神经损伤及认知功能

目的:探讨三七皂苷Rg1对血管性痴呆(VD)大鼠神经损伤及认知功能的影响及其机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为:假手术组、模型组、尼莫地平(15 mg/kg)阳性对照组及三七皂苷Rg1低(25 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组,每组10只。除假手术组外,其余各组均采用双侧颈总动脉缺血-再灌注法建立血管性痴呆大鼠模型,造模结束后第2天灌胃给药,1次/d,共8 w。采用Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力;取大鼠海马组织,化学比色法检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;ELISA法检测海马组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;TUNEL染色检测大鼠海马组织神经元凋亡情况;Western blot分析大鼠海马组织中cleaved-Caspase-3、磷酸化丝裂原激活蛋白激酶5(p-MEK5)、MEK5、磷酸化细胞外信号调节激酶5(p-ERK5)和ERK5等蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠认知能力显著降低,海马组织神经元凋亡率显著升高,海马组织SOD活性及p-MEK5/MEK5、p-ERK5/ERK5水平显著降低,海马组织MDA、IL-1β、TNF-α水平及cleaved-Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,高剂量三七皂苷Rg1能显著改善VD大鼠认知功能,降低海马神经元凋亡率,提高海马组织SOD活性及p-MEK5/MEK5、p-ERK5/ERK5水平,降低海马组织中MDA、IL-1β、TNF-α水平及cleaved-Caspase-3蛋白表达(P<0.05)。结论:三七皂苷Rg1能抑制海马神经元凋亡,改善海马组织炎症和氧化损伤,从而提高VD大鼠认知功能,其机制可能与MEK5/ERK5信号通路激活有关。

ERK1/2、MEK1/2在盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带组织中的表达

目的:研究ERK1/2、MEK1/2在盆腔器官脱垂(POP)患者子宫骶韧带组织中的表达及意义。方法:选择30例因POP行子宫切除术或盆底重建术的患者为POP组,POP定量分期评分均为Ⅲ~Ⅳ度;选择同时期33例因非盆底功能障碍性疾病行子宫切除术的患者为对照组,POP定量分期评分均为0~Ⅰ度。收集患者术中废弃的近宫颈处子宫骶韧带组织,采用HE及Masson染色评估其组织学表现,采用免疫组化法和Western blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2的表达情况。结果:POP组子宫骶韧带组织学结构明显区别于对照组,且ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2的相对表达量及p-ERK/ERK、p-MEK/MEK比值均低于对照组(P<0.05)。结论:ERK1/2与MEK1/2在POP患者子宫骶韧带组织中表达减少以及p-ERK/ERK和p-MEK/MEK比值降低可能与POP的发生有关。

下调IGF-1通过CREB信号通路失活间接加重大鼠脑缺血损伤

目的探讨MEK/ERK/CREB信号通路是否介导IGF-1在大鼠脑缺血中的调控作用。方法成年雄性SD大鼠使用MACO线栓法建立永久性局灶性脑缺血模型,进行m NSS神经功能缺损评分,脑缺血48 h时进行TTC染色观察脑梗死情况、末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,并利用实时荧光定量PCR和Western blot检测缺血同侧大脑皮质内IGF-1及下游信号分子MEK、ERK1/2和CREB的mRNA和蛋白表达变化,及其磷酸化水平的变化情况。结果脑缺血组大鼠m NSS评分、细胞凋亡百分比均明显高于假手术组,缺血大脑皮质内IGF-1表达下调,MEK、ERK1/2和CREB的基因水平下降,MEK、ERK1/2的蛋白水平及其磷酸化蛋白水平均明显降低。结论本实验结果表明永久性局灶性脑缺血早期大鼠皮质内下调的IGF-1,可以通过负调控MEK/ERK/CREB促存活信号通路,间接加重大鼠脑缺血性损伤。

三七总皂苷对慢性肾衰竭大鼠AngⅡ/AT1R/ERK1/2信号通路的影响

目的研究三七总皂苷(PNS)对腺嘌呤诱导的慢性肾衰竭(CRF)大鼠AngⅡ/AT1R/ERK1/2信号通路的影响,探讨其延缓慢性肾衰竭进展的作用机制。方法将65只雄性SD大鼠随机分为正常组10只、造模组55只,正常组常规饲养,造模组采用250 mg·kg^(-1)·d^(-1)腺嘌呤混悬液连续灌胃28 d复制CRF大鼠模型。将造模成功大鼠随机分为模型组、贝那普利组(10 mg·kg^(-1))及PNS低、中、高(40、80、160 mg·kg^(-1))剂量组,灌胃给药,每日1次,连续28 d。检测大鼠24 h尿蛋白(24 h U-pro)及血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量;采用HE染色法观察肾组织病理形态,Masson染色法观察肾间质纤维化程度;采用ELISA法检测血清及肾组织匀浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血清中胱抑素C(Cys-C)的含量;采用Western Blot法分析肾组织中血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型(AT1R)、细胞外调节激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达情况;Real-time PCR法检测肾组织中AngⅡ、AT1R、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的表达;免疫组化法检测肾组织中AT1R蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠的24 h U-pro、Scr、BUN、Cys-C水平显著升高(P<0.01),血清、肾组织匀浆中的AngⅡ含量明显增加(P<0.01),肾组织中的AngⅡ、AT1R、CTGF mRNA表达均明显上调(P<0.01),AT1R、p-ERK1/2蛋白表达均明显上调(P<0.01)。与模型组比较,给药组大鼠的Scr、BUN、24 h U-pro及Cys-C水平均明显降低(P<0.05,P<0.01),血清、肾组织中的AngⅡ含量均明显降低(P<0.05,P<0.01),肾组织中的AngⅡ、AT1R、CTGF mRNA表达均明显下调(P<0.05,P<0.01),AT1R、p-ERK1/2蛋白表达均明显下调(P<0.05,P<0.01)。结论三七总皂苷可改善CRF模型大鼠的肾功能和肾脏的病理学改变,其机制可能与调控AngⅡ/AT1R/ERK1/2信号通路有关。

千里光菲灵碱诱导MEK/ERK1/2介导的宫颈癌细胞自噬效应

探讨千里光菲灵碱对人宫颈癌He La、Caski细胞增殖、自噬的影响及其可能的作用机制。MTT法检测千里光菲灵碱对He La、Caski细胞增殖的影响;免疫荧光法检测GFP-LC3/He La和GFP-LC3/Caski两种细胞内自噬体的形成情况;免疫印迹法检测千里光菲灵碱对自噬相关蛋白表达的影响;荧光共定位法检测自噬体与溶酶体的融合情况;建立荷宫颈癌He La、Caski细胞移植瘤裸鼠模型,检测千里光菲灵碱对移植瘤生长的抑制作用。结果显示,千里光菲灵碱呈时间和剂量依赖性抑制He La、Caski两种宫颈癌细胞的增殖;千里光菲灵碱可诱导He La、Caski细胞内自噬体的形成和LC3-II蛋白的增加及P62蛋白的减少,表明千里光菲灵碱可诱导He La、Caski细胞发生自噬;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬下游抑制剂氯喹(CQ)显著增加了LC3-II及P62的蛋白表达,同时荧光共定位显示千里光菲灵碱诱导的自噬体可与溶酶体实现共定位,表明千里光菲灵碱可诱导完整自噬流;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬上游抑制3-甲基腺嘌呤(3MA)剂显著增加了LC3-II的蛋白表达,显著降低了He La、Caski细胞的存活率,表明抑制自噬可增强千里光菲灵碱对宫颈癌细胞增殖的抑制作用;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合MEK抑制剂显著降低了P-ERK1/2的蛋白表达,减少了自噬体的形成,表明千里光菲灵碱诱导的He La、Caski细胞自噬依赖于MEK/ERK1/2途径;另外,千里光菲灵碱可显著抑制宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

基于OX1R/PLCβ-1/PKCα/ERK1/2信号通路探讨安寐丹对失眠模型大鼠肝脏神经递质和昼夜节律的影响及机制

目的:基于食欲素受体1(OX1R)/磷脂酰肌醇特异性磷酯酶Cβ-1(PLCβ-1)/蛋白激酶Cα(PKCα)/细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路探讨安寐丹对失眠大鼠肝脏神经递质及昼夜节律的影响及机制。方法:SPF级SD大鼠60只,随机分为空白组、模型组、苏沃雷生组、安寐丹低、中、高剂量组,各10只;除空白组外,其余各组通过腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)进行造模,空白组给予等容生理盐水、苏沃雷生组给予苏沃雷生溶液30 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃、安寐丹低、中、高剂量组分别给予安寐丹水煎液(4.55、9.09、18.18 g·kg^(-1)·d^(-1));观察各组一般情况、体质量和24 h自主活动情况;采用苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察肝脏病理学改变,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肝脏神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、肾上腺素(EPI)、去甲肾上腺素(NE)和乙酰胆碱(ACh)的表达,生化检测肝脏谷氨酸(Glu)的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肝脏生物钟基因Per1、Per2、Cry1、Cry2、Bmal1、Bmal2的m RNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)、Real-time PCR检测肝脏OX1R/PLCβ-1/PKCα/ERK1/2信号通路蛋白及m RNA表达。结果:与空白组比较,模型组体质量下降(P<0.05,P<0.01),狂躁、静止节律紊乱(P<0.01),肝脏肌纤维断裂、水肿伴炎性细胞浸润,GABA、5-HT、EPI、NE和ACh含量降低、Glu含量升高(P<0.01),Per1、Per2、Cry1和Cry2 m RNA表达降低(P<0.01),Bmal1和Bmal2 m RNA表达升高(P<0.01),OX1R、PLCβ-1、PKCα、ERK1/2蛋白及m RNA基因表达均增高(P<0.01);与模型组比较,苏沃雷生和安寐丹低、中、高剂量组可增加失眠大鼠体质量(P<0.05,P<0.01),减少狂躁状态、增加其静止时间和频率(P<0.05,P<0.01),并可上调神经递质GABA、5-HT、EPI、NE、ACh和节律基因Per1、Per2、Cry1、Cry2 m RNA表达(P<0.05,P<0.01),抑制Glu及Bmal1、Bmal2、OX1R、PLCβ-1、PKCα、ERK1/2 m RNA和OX1R、PLCβ-1、PKCα、ERK1/2蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:安寐丹可通过抑制OX1R/PLCβ-1/PKCα/ERK1/2信号通路调节失眠大鼠肝脏神经递质表达,改善昼夜节律紊乱,且安寐丹高剂量组效果最佳。

FTH1激活RAF/MEK/ERK通路促进肝细胞癌生长

[目的]应用生物信息学和分子生物学手段研究铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)中的功能和分子机制。[方法]通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)、TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)、TNMplot和GEPIA2(Gene Expression Omnibus)等公开数据库的数据进行分析FTH1在肝癌中的表达量和预后生存期,同时应用分子生物学实验在肝癌细胞系中分析FTH1的作用机制。[结果]在肝癌组织中FTH1的表达量高于正常(P<0.01),同时FTH1高表达的HCC患者预后更差(P<0.01)。蛋白免疫印迹分析和荧光定量PCR细胞实验表明,与正常肝细胞L02相比,肝癌细胞系HepG2和Huh7中FTH1的mRNA及蛋白水平明显升高(P<0.01)。MTT和细胞克隆形成实验结果表明FTH1敲低的HepG2和Huh7细胞增殖能力降低40%~50%。进一步蛋白免疫印迹结果显示FTH1敲低的细胞中RAF、MEK和ERK的磷酸化水平明显降低(P<0.05)。[结论] FTH1可通过激活RAF/MEK/ERK信号通路促进HCC细胞的生长。

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.

PTPIP51、p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的探讨PTPIP51和p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达及对口腔鳞癌侵袭、转移的影响。方法收集32例口腔鳞状细胞癌及其配对癌旁正常口腔黏膜组织。用免疫荧光组织化学染色激光共聚焦显微镜检测PTPIP51与p-Raf-1蛋白在组织切片内表达及定位;PBS冲洗后对标本进行苏木精-伊红染色,普通光镜对比观察组织结构及细胞形态,同时用免疫组织化学方法(SP法)检测PTPIP51蛋白在组织和细胞内的定位;Rea-ltime PCR检测PT-PIP51与ERK1/2基因mRNA在肿瘤组织及癌旁正常口腔黏膜组织的表达情况。结果 PTPIP51与p-Raf-1蛋白在癌巢周围增殖旺盛的肿瘤细胞、间质免疫细胞及部分脉管壁内皮细胞表达阳性且2种蛋白在细胞中共定位表达。同时发现PTPIP51与ERK1/2基因mRNA在口腔鳞癌组织表达高于配对癌旁正常口腔黏膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05);ERK1/2及PTPIP51基因mRNA表达呈正相关(r=0.641,P<0.05);两者的表达水平与患者的性别、年龄,病理分级无关,与肿瘤的TNM分级及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 PTPIP51与Raf-1可能通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程,且2种蛋白与肿瘤的侵袭、转移有密切关系。

丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2信号通路在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用

目的探讨丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)1/2信号通路在大鼠实验性蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中的作用。方法取成年雄性SD大鼠60只,随机分为对照组,SAH造模后1、6、12、24、48、72 h组,SAH+MEK抑制剂U0126干预24、48、72 h组,共10组,每组6只。除对照组外,另9组大鼠于枕大池注血制备SAH模型,于眶下静脉丛取血。采用酶联免疫吸附法测定各组血清白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,脑组织伊文思蓝含量测定评定血-脑屏障损伤,Western-blot法测定基底动脉组织中磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的水平并加以比较。结果 SAH组大鼠造模后6、12、24、48、72 h,血清IL-6、IL-1β水平与对照组同一时间点比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);造模后24、48、72 h,SAH组大鼠血清TNF-α水平均高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。造模后12、24、48、72 h,SAH组大鼠基底动脉组织p-ERK1/2蛋白表达水平分别为0.73±0.09、0.85±0.12、0.94±0.09、0.96±0.09,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。SAH组造模后48、72 h,MMP-9蛋白水平明显高于对照组(1.27±0.15比0.68±0.08、2.41±0.11比0.71±0.14)。造模后72 h,SAH组脑组织伊文思蓝含量明显高于对照组[(15.3±2.2)μg/g比(2.7±0.4)μg/g]。给予MEK抑制剂U0126干预后,造模后24、48、72 h血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平,造模后48、72 h p-ERK1/2、MMP-9蛋白表达水平(p-ERK1/2:0.76±0.07、0.81±0.06;MMP-9:0.92±0.14、1.79±0.16),以及造模后72 h脑组织伊文思蓝含量[(8.9±1.7)μg/g]均明显低于SAH组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 MEK/ERK1/2信号通路与大鼠实验性SAH后炎性反应及血-脑屏障损伤密切相关,提示干预MEK/ERK1/2信号通路可能为预防SAH后早期脑损伤的潜在靶点。

SPARCL1通过MEK/ERK信号通路调节非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭

目的:分析富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(SPARCL1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡、侵袭的影响,并探讨分裂原活化抑制剂(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路在其中发挥的作用。方法:收集2019年9月~2021年6月期间本院接受手术治疗的84例NSCLC患者癌组织与相应癌旁组织,实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法测定并比较各组织以及正常肺上皮细胞HBEpiC、NSCLC细胞A549、HCC827、H1299、H292中SPARCL1信使RNA(m RNA)表达水平,选取A549、HCC827培养并分组,分为对照组、NC si RNA组、SPARCL1 si RNA组、U0126组(MEK/ERK特异性抑制剂)、SPARCL1 si RNA加U0126组,细胞计数法(CCK8)以及平板克隆法测定A549、HCC827细胞增殖,流式细胞仪测定A549、HCC827细胞凋亡,Transwell小室法测定A549、HCC827细胞侵袭能力,蛋白质印迹法(western blot)检测SPARCL1、p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达。结果:SPARCL1在NSCLC组织中m RNA表达水平低于癌旁组织(P<0.05);与HBEpiC细胞相比,NSCLC细胞A549、HCC827、H1299、H292细胞中SPARCL1 m RNA表达水平降低(P<0.05);与对照组相比,SPARCL1 si RNA组A549、HCC827细胞SPARCL1 m RNA表达水平与蛋白表达、凋亡率降低(P<0.05),OD_(450)、克隆形成数、侵袭细胞数、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高(P<0.05),U0126组A549、HCC827细胞SPARCL1 m RNA表达水平与蛋白表达、凋亡率升高(P<0.05),OD_(450)、克隆形成数、侵袭细胞数、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低(P<0.05);与SPARCL1 si RNA组相比,SPARCL1 si RNA加U0126组A549、HCC827细胞SPARCL1 m RNA表达水平与蛋白表达、凋亡率升高(P<0.05),OD_(450)、克隆形成数、侵袭细胞数、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低(P<0.05)。结论:SPARCL1可能通过调控MEK/ERK通路影响NSCLC A549、HCC827细胞增殖、侵袭与凋亡。

miR-223靶向下调IGF1R基因表达对抑制卵巢颗粒细胞增殖及促进凋亡的影响

目的探讨miR-223通过靶向下调IGF1R-AKT/mTOR通路对卵巢颗粒细胞增殖及其凋亡的影响。方法体外培养人卵巢颗粒细胞,通过慢病毒基因表达调控技术,构建正常对照组、慢病毒对照治疗组、miR-223 Mimics组(Mimics组),用CCK8细胞增殖检测各组细胞增殖状态,流式细胞仪检测各组细胞周期分布及细胞凋亡率,Western-Blot、Q-PCR技术检测IGF1R-AKT/mTOR通路关键基因蛋白表达。结果Mimics组miR-223表达显著上调,与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);Mimics组卵巢颗粒细胞增殖受阻,G1期细胞比例增加,细胞凋亡率增加,与正常对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05);Western-blot、Q-PCR检测显示Mimics组IGF1R基因表达下调且磷酸化S6K1(p-S6K1)、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)蛋白含量减少,与正常对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论miR-223靶向下调IGF1R-AKT/mTOR通路可抑制卵巢颗粒细胞增殖,促进卵巢颗粒细胞凋亡。

TGF-β和IGF-1信号通路调控肾母细胞瘤细胞增殖机制探讨

目的肾母细胞瘤是一种高发的儿童实体瘤,发病率占儿童恶性肿瘤8%~10%,多发生于<5岁儿童,有研究表明某些信号通路可调控其增殖过程。本研究探讨TGF-β和IGF-1信号通路是否共同参与调控肾母细胞瘤细胞的增殖过程。方法采用siRNA转染实验将TGFBR1-siRNA和IGF1R-siRNA转至肾母细胞瘤细胞株G401,以转染不同siRNA分为TGFBR1-siRNA组和IGF1R-siRNA组,siRNA无关序列(non-siRNA)转染组作为对照组,每组设6个复孔。MTS方法检测TGFBR1-siRNA和IGF1R-siRNA对细胞增殖率的影响,蛋白质印迹法检测TGF-β信号通路TGFBR1及下游蛋白p-ERK、SMAD2/3和p-AKT蛋白表达情况;蛋白质印迹法检测IGF-1信号通路IGF1R及下游蛋白p-AKT蛋白表达情况。ELISA法检测细胞上清中FGF9蛋白表达。结果抑制TGFBR1和IGF1R72和96h后,细胞的增殖率受到抑制,对照组增殖率设为100%。与其相比,转染TGFBR1-siRNA 72h后的实验组和对照组的增殖率分别为(80±14)%和(100±7)%,实验组低于对照组,P=0.034;转染IGF1R-siRNA 72h后实验组和对照组的增值率分别为(85±21)%和(100±7)%,实验组低于对照组,P=0.028。转染TGFBR1-siRNA 96h后的实验组和对照组的增殖率分别为(81±13)%和(100±11)%,实验组低于对照组,P=0.021;转染IGF1R-siRNA 96h后实验组和对照组的增殖率分别为(82±17)%和(100±11)%,实验组低于对照组,P=0.038。抑制TGFBR1后,与non-siRNA组相比,下游蛋白FGF-9、p-ERK、SMAD2/3和p-AKT明显受到抑制。TGFBR1-siRNA转染72h后,实验组细胞上清中FGF9蛋白表达量显著下降,实验组为(533.85±54.64)ρg/mL,对照组为(587.34±46.83)ρg/mL,P=0.041;96h后实验组FGF9蛋白表达量仍显著低于对照组,实验组为(495.03±59.26)ρg/mL,对照组为(605.34±49.28)ρg/mL,P=0.018。TGFBR1-siRNA转染48h后,p-ERK、SMAD2/3和p-AKT蛋白表达量出现降低;72h后,p-ERK和SMAD2/3蛋白表达量仍降低。与non-siRNA转染对照组相比,IGF1R-siRNA转染72和96h后,p-AKT蛋白表达量出现降低。结论TGF-β和IGF-1信号通路共同参与肾母细胞瘤细胞的增殖,两条信号通路可能通过共同的下游蛋白AKT参与对肾母细胞瘤增殖的调控,TGFBR1和IGF1R可以作为肾母细胞瘤治疗的靶点深入研究。

STIP1基因沉默对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨磷酸化应激诱导蛋白1基因沉默(si-STIP1)对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法体外培养人成骨细胞(hFOB1.19细胞)和人骨肉瘤细胞系(U2OS、MG63和SaoS-2细胞),采用实时定量PCR和蛋白印迹法测定磷酸化应激诱导蛋白1(STIP1)在各细胞中的表达水平。si-STIP1及阴性对照(si-NC)转染U2OS细胞48 h,采用CCK-8法测定细胞增殖,Transwell实验测定细胞迁移和侵袭,采用蛋白印迹测定细胞MMP2和MMP9及IGF1R/PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。结果与hFOB1.19细胞相比,U2OS、MG63和SaoS-2细胞的STIP1基因和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。与si-NC组相比,si-STIP1组U2OS细胞的增殖活性、迁移率、侵袭率均显著降低(均P<0.05),MMP2、MMP9、p-IGF1R、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)。结论STIP1基因沉默抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移,其可能机制是通过调控IGF1R/PI3K/AKT信号通路实现。

IGF2信号通路在As_(2)O_(3)致GC-2细胞凋亡中的作用

砷是一种天然类金属化学元素,广泛存在于自然界中,是世界卫生组织公布的引起重大公共关注的10种危害环境与健康的化学品之一^([1])。砷也是一种雄性生殖毒物,可以下调精子质量^([2])。流行病学报告显示,饮用水中砷含量超标导致男性血液和精液中砷含量明显升高,并造成男性精子数量和精子存活率的下降[3-4]。动物实验也发现,慢性砷暴露降低小鼠精子质量[5-6]。IGF2(胰岛素样生长因子2)信号通路是与男性生殖关系密切的信号通路.