中华鳖IGF2和IGF2R基因克隆及其功能研究

【目的】探索胰岛素样生长因子2基因(IGF2)和胰岛素样生长因子2受体基因(IGF2R)在中华鳖生长过程中发挥的作用,为揭示IGFs系统在中华鳖异速生长及两性生长差异中的作用机制打下基础。【方法】采用RACE克隆中华鳖IGF2和IGF2R基因c DNA序列,利用BioEdit、ExPASy、TMHMM Server v2.0、SignalP及SMART等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR分析IGF2和IGF2R基因在雌雄中华鳖不同组织、不同表型及不同性类固醇激素处理下的表达变化。【结果】中华鳖IGF2基因cDNA序列全长1180 bp,共编码222个氨基酸残基;IGF2蛋白相对分子量为24.84 kD,理论等电点(pI)为9.00,属于跨膜蛋白,含有1个IIGF结构域。中华鳖IGF2R基因cDNA序列全长8765bp,共编码2443个氨基酸残基;IGF2R蛋白相对分子量为271.92kD,pI为5.64,属于跨膜蛋白,含有14个重复的CIMR结构域和1个FN2结构域。基于IGF2和IGF2R氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,中华鳖与龟鳖类的亲缘关系最近,与鱼类和两栖动物的亲缘关系相对较远。IGF2和IGF2R基因在中华鳖体内具有广泛的组织表达谱,IGF2基因在精巢中的相对表达量显著高于卵巢(P<0.05,下同),IGF2R基因则恰好相反。IGF2基因在成年中华鳖生长快个体肝脏中的相对表达量显著高于生长慢个体,IGF2R基因的表达模式则相反。在雌二醇(E2)处理下,除雌性中华鳖肝脏中的IGF2R基因相对表达量在注射6 h时显著升高外,IGF2和IGF2R基因在雌雄个体肝脏中的相对表达量整体上呈下降趋势;MT处理对雄性个体肝脏中IGF2基因的表达无显著影响(P>0.05),但在注射48 h后显著提高雌性个体肝脏中的IGF2基因相对表达量,且显著下调雌性中华鳖肝脏中的IGF2R基因相对表达量。【结论】IGF2和IGF2R基因参与调控中华鳖性腺的发育及成熟,且IGF2R可能通过内化降解IGF2而对中华鳖的生长起负调控作用。此外,IGF2和IGF2R基因会通过下调表达量来响应外源激素的刺激,进而实现对中华鳖生长的调控。

牦牛IGF2基因克隆及生物信息学分析

为探究牦牛IGF2基因生物学的特征及结构,利用RT-PCR方法克隆了IGF2基因CDS区,并进行了生物信息学分析。结果表明,IGF2基因共有5个开放阅读框,编码区长540 bp,共编码179个氨基酸。该基因编码的蛋白分子式为C864H1377N251O257S9,分子量为19681.51 Da,原子总数2758个,理论等电点9.11,不稳定系数为59.56,总平均亲水性为-0.184,属于亲水性蛋白。IGF2编码蛋白具有73个磷酸化位点且仅存在于细胞质中。通过系统进化树的构建,发现美仁牦牛在进化过程中相对保守。

IGF2基因PCR-RFLP多态性与脂肪沉积相关性状的关联分析

胰岛素样生长因子 2在胎儿生长发育、肿瘤细胞增殖、肌肉生长等方面具有重要的调控作用 ,是影响猪瘦肉量的主要候选基因。采用PCR RFLP技术 ,分析了IGF2基因第 8内含子部分片段在猪资源家系群体中的NciⅠ酶切片段多态性分布。IGF2基因该片段具有两个NciⅠ酶切位点 (切点位于第 8内含子 ,分别记录为位点A和位点B) ,两位点在资源家系中均具有多态性。IGF2基因B位点酶切未突变个体均比酶切突变的个体背膘薄 18 2 8% (P<0 0 1) ,肥肉率低 2 2 4 3% (P <0 0 1) ,瘦肉率高 8 71% (P <0 0 1) ,位点A具有相同的影响趋势。在该研究群体中 ,IGF2基因发挥作用的方式主要为加性效应 。

应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率

IGF2(Insulin-like growth factor 2)基因作为最复杂多样的生长因子之一,对猪胎儿发育以及出生后生长发育和肌肉生成起着非常重要的作用。通过基因组编辑技术对我国本地猪种的IGF2基因作精确的遗传修饰,对于提高本地猪种的瘦肉率具有重要的育种意义。文章在蓝塘猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts,PEF)中检测了锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)和CRISPR/Cas9对IGF2基因的打靶效率,结果表明CRISPR/Cas9对IGF2基因的切割效率最高可达9.2%,显著高于ZFN的切割效率(<1%),但两者均未达到作为体细胞核移植(Somatic nuclear transfer,SCNT)供体细胞所需的打靶效率。应用SSA(Single-strand annealing)报告载体筛选技术来富集IGF2基因被ZFN和CRISPR/Cas9修饰过的PEF细胞,结果表明,该技术可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右,对ZFN的打靶效率具有更大的增强作用。

秦川牛IGF2基因SNPs检测及其与胴体、肉质性状的相关性

采用PCR-SSCP方法对186头24月龄秦川牛IGF2基因进行了SNPs多态性检测,并将其与部分胴体和肉质性状进行关联分析。在IGF2基因120碱基处发现C→T突变,在279碱基处发现A→G突变。方差分析结果表明:BB、DD两个位点与胴体性状中与宰前活重、胴体重、胴体长、胴体胸深、眼肌面积显著相关(P<0.05),其中背部皮下脂肪厚达到差异极显著(P<0.01);与肉质性状大理石花纹、嫩度、pH24(牛肉排酸24h后的酸度值)显著相关(P<0.05)。但是在胴体深、系水力指标中差异不显著(P>0.05)。A、D等位基因是群体中的优势等位基因,AA、DD基因型是优势基因型,而含有B、D等位基因的个体的胴体和肉质性状优于其他个体。

不同猪种IGF2基因PCR-RFLP多态性与部分生长性状相关性分析

以IGF2基因作为控制猪生长性状主基因的候选基因,采用PCR-RFLP方法对7个品种/群体共528头猪进行了NciⅠ酶切位点基因型检测,计算了该位点的基因频率与基因型频率,并对品种间基因型频率进行了x2差异性检验.结合生长性能记录,运用SAS软件分析了IGF2不同基因型对生长性状的遗传效应.结果表明:在杜洛克、长白、大白中,AA基因型比BB基因型生长速率快,生长性能指数高4.06%～8.31%,等位基因A对猪的生长具有正效应.

猪IGF2基因G3072A位点多态性及其与大白猪初生重和早期生长的关系

本研究采用PCR-SSCP技术对猪胰岛素样生长因子2（IGF2）基因G3072A位点在大白、长白和杜洛克猪群体的单核苷酸多态性（SNP）进行了检测，对其与大白猪初生重和早期生长的关系进行了分析。结果表明，在所分析的大白、长白和杜洛克猪群体的511个体中，IGF2基因在该位点均呈现多态性，大白、长白和杜洛克猪群体AA、AB和BB基因型均有分布，且大白和长白猪群体均显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P〈0．01），而杜洛克猪群未偏离Hardy-Weinberg平衡（P〉0．05）。测序结果显示，等位基因A和B分别对应于核苷酸A和G，在A等位基因中，有（AG）二核苷酸的插入。关联分析表明，在大白猪群中，AA、AB和BB基因型个体的初生重差异显著（P〈0．05），AA和AB基因型个体的21、28和70日龄体重以及从出生～21日龄、21～28日龄、28～70日龄的日增重差异不显著（P〉0．1）。

五指山猪IGF2基因5'调控区单核苷酸多态性分析

利用PCR产物直接测序法,对五指山猪、滇南小耳猪、香猪、梅山猪和大白猪共60个样本的IGF2基因5'调控区部分片段的单核苷酸多态性进行了研究。找到13个SNP,分别是:C5872T、C5888T、A5976G、C6010T、T6029A、C6037T、C6043T、C6063T、C6112T、C6164T、G13520A、G13563A和G13669A。T6029A为T←→A碱基颠换,A5976G、G13520A、G13563A和G13669A为A←→G转换,其他均为C←→T转换。针对13个SNP位点得到23种组合基因型。统计各位点等位基因和基因型以及各组合基因型在总群体与各品种内的分布频率,发现3个小型猪在A5976G、C6164T和G13669A位点上的优势等位基因均分别为G、T和A,而梅山猪和大白猪的优势等位基因均分别为A、C和G;H19型为3个小型猪的特征组合基因型,而另两个猪品种为H15型。同时对123头五指山猪IGF2基因C5888T位点进行了PCR-RFLP分析,研究表明该位点C为优势等位基因(0.8536),CC为优势基因型(0.7235)。卡方检验表明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。这些结果可为五指山猪等小型猪的生长发育规律、矮小机制等方面的研究提供遗传学依据。

长白和蓝塘猪印记基因IGF2和H19的时空表达研究

运用实时荧光定量PCR技术,检测IGF2和H19印记基因在长白猪和蓝塘猪中的表达水平.测定了1日龄和180日龄2个阶段的基因在各组织中的转录表达水平,按照生长性状分组,对组间的表达差异进行了比较分析.分析不同日龄长白、蓝塘猪各组织中IGF2、H19的表达量.结果显示,仔猪初生体质量大的组肝脏组织中IGF2基因表达水平显著高于初生体质量轻的组;180日龄猪皮脂厚的组脂肪组织的IGF2基因表达量高于皮脂薄的组;1日龄仔猪肝脏、肌肉和胃组织中IGF2表达量高于其他测定组织和180日龄的各组织;180日龄蓝塘猪肾脏组织中的H19表达量显著升高.

猪IGF2基因的遗传多态性及其遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法检测胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因外显子7,8,9的多态性,并分析其对初生重、断奶重、6月龄重和6月龄背膘厚的遗传效应。根据猪IGF2基因的DNA序列(AY044828)设计3对引物,结果在Ex8引物对扩增的片段上发现了多态性,并对纯合子进行测序,发现exon8的53位存在C→T转换,且检测到3种基因型(AA、AB、BB)。统计结果表明,3种基因型在各品种中的分布不一致,长白猪与大白猪比较,莱芜猪与大薄莲猪比较,沂蒙黑猪和里岔黑猪比较差异不显著(P>0.05);其他猪种间基因型分布的差异均显著(P<0.01)。固定效应模型分析结果表明,初生重和6月龄背膘厚基因型间差异显著(P<0.05),而断奶重和6月龄重基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型个体同AA和AB基因型个体比较初生重的差异显著(P<0.05),3种基因型在初生重的大小排列顺序为AB>AA>BB;AA基因型个体同AB和BB基因型个体比较6月龄背膘厚的差异显著(P<0.05),3种基因型在6月龄背膘厚的大小排列顺序为BB>AB>AA。因此,推测IGF2基因对个体的初生重和胴体瘦肉率存在一定的影响,将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择可以加快猪的育种进程。

双棘黄姑鱼IGF2基因克隆及其在卵巢发育中的作用研究

运用RT-PCR和RACE技术,首次克隆了双棘黄姑鱼(Protonibea diacanthus)的IGF2 cDNA。双棘黄姑鱼IGF2cDNA全长842bp,其中开放阅读框为648bp,5′非翻译区为125bp,3′非翻译区为69bp。IGF2前体mRNA编码215个氨基酸,成熟肽为71个氨基酸残基的多肽。多重氨基酸比对结果显示,双棘黄姑鱼与其他鱼类IGF2氨基酸序列高度保守。同源性分析表明,双棘黄姑鱼IGF2氨基酸序列与同属鲈形目的斜带石斑鱼、金头鲷、罗非鱼同源性分别为95.8%、95.3%和91.2%。系统进化树结果与同源性分析结果相似,双棘黄姑鱼IGF2基因首先与同属鲈形目的斜带石斑鱼、金头鲷、罗非鱼类聚,再与虹鳟、牙鲆、黄颡鱼的IGF2和斑马鱼IGF2b基因聚为一支,最后与斑马鱼IGF2a类聚为鱼类IGF2基因。组织分布结果表明,IGF2基因在双棘黄姑鱼各组织中表达广泛。RT-PCR结果显示,双棘黄姑鱼卵巢成熟期和退化期的IGF2表达量显著高于发育期,推测IGF2的表达可能促进了双棘黄姑鱼卵巢的成熟。

IGF2基因表达调控及其遗传变异在动物生长发育中的研究进展

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)作为胰岛素类激素家族中重要成员之一,广泛参与机体众多生理代谢过程,在癌症发生、神经调节、糖代谢疾病、骨质疏松、肌肉发育和脂肪沉积等方面具有重要的作用,其功能行使主要通过与受体IGF1R和IGF2R结合或与胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBPs和IGF2BPs竞争性结合发挥功能。鉴于IGF2基因在肌肉发育和脂肪沉积中的重要作用,发掘IGF2基因相关分子标记并解析其内在调控机理,在畜牧生产中具有重要的意义。研究发现,众多IGF2基因遗传变异与动物的生长发育之间存在显著相关关系,其可能通过影响IGF2基因印记、甲基化状态、转录因子结合或miRNA靶向结合型转录后调控等方式发挥作用。因此,文章综述了IGF2基因表达调控模式,包括IGF2与其受体的调控关系,基因印记与miRNA参与的表观遗传调控,转录因子对其的调节作用,遗传变异等方面的内容,以期为IGF2基因在动物生长发育调控相关研究中提供相应的借鉴,为分子育种提供有效线索。

郏县红牛IGF2基因多态性与生长性状关系研究

本研究利用PCR-SSCP技术首次对郏县红牛母牛IGF2基因多态性及其与生长性状关系进行了研究。结果表明:IGF2基因第2外显子表现多态性,存在AA、AB、BB三种不同基因型。其频率分别为0.235/0.480/0.285;A/B等位基因频率分别为0.474/0.526;该位点纯合度为0.501,杂合度为0.499,位点间有效等位基因数为1.996。该基因位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。通过对郏县红牛IGF2基因第2外显子位点不同基因型与样本体重及其它体尺指标的关联分析表明:不同基因型对胸围(P<0.01)和体重(P<0.05)有显著影响,AB基因型个体的胸围和体重明显大于AA和BB型个体。说明IGF2基因可以作为标记用于郏县红牛的肉用选育。

猪IGF2基因外显子3的遗传多态性及遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法检测猪胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,IGF2)基因外显子3多态性,分析其对初生重、断奶重、6月龄重和背膘厚的遗传效应.根据猪IGF2基因的DNA序列(AY044828)设计引物,结果在其扩增片段上检测到多态性,对纯合子进行测序,发现IGF2-ex3-A36T和IGF2-ex3-G109A两个多态性位点,并且这2个多态性位点完全连锁,检测到3种基因型(A36A/G109G,A36T/G109A和T36T/A109A).统计结果表明,基因型在各品种中分布不一致,长白猪和大白猪与莱芜猪、大薄莲猪、沂蒙黑猪和里岔黑猪比较基因型分布差异极显著(P<0.01);其它猪种间基因型分布差异均不显著(P>0.05).固定效应模型分析结果表明,初生重和背膘厚基因型间差异显著(P<0.05),而断奶重和6月龄重基因型间差异不显著(P>0.05).最小二乘分析结果表明,A36A/G109G基因型个体同A36T/G109A和T36T/A109A基因型个体比较初生重和背膘厚的差异显著(P<0.05),3种基因型初生重的大小排列顺序为A36A/G109G<A36T/G109A<T36T/A109A,背膘厚的大小排列顺序为A36A/G109G>A36T/G109A>T36T/A109A.因此,推测IGF2基因对个体的初生重和胴体瘦肉率存在一定的影响,将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择,将可以改善猪肉品质,加快猪的育种进程.

猪IGF2基因外显子4b的遗传多态性及其遗传效应

采用PCR-SSCP方法检测猪胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因外显子4b的多态性,并分析其对初生重、断奶重、6月龄重和背膘厚的遗传效应。根据猪IGF2基因的DNA序列(AY044828)设计引物,在exon4b上发现了一个多态性位点,并对纯合子进行测序,发现13位C→A转换,且存在3种基因型(AA、AB、BB)。统计结果表明,3种基因型在各品种中的分布不一致,长白猪与大白猪比较,莱芜猪与大薄莲猪比较,沂蒙黑猪和里岔黑猪比较差异不显著(P>0.05);其他猪种间基因型分布的差异均显著(P<0.05)。固定效应模型分析结果表明,初生重,断奶重和背膘厚基因型间差异显著(P<0.05),而6月龄重基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型个体同AA和AB、基因型个体比较初生重和断奶重的差异显著(P<0.05),3种基因型在初生重和断奶重的大小排列顺序为AA>AB>BB;AA基因型个体同AB和BB基因型个体比较背膘厚的差异显著(P<0.05),3种基因型在背膘厚的大小排列顺序为BB>AB>AA。因此,推测IGF2基因对个体的生长速度和胴体瘦肉率存在一定的影响,将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择可以加快猪的育种进程。

猪IGF2 Intron3 G3072A突变及其在背最长肌中差异表达

采用错配PCR-RFLP法检测胰岛素样生长因子2基因(IGF2)内含子3的G3072A位点变异对长×大杂交猪肌肉生长和脂肪沉积的影响,并采用实时荧光定量PCR法分析该变异对出生后的长×大杂交后代猪背最长肌中IGF2mRNA表达发育性变化的影响。结果显示:IGF2内含子3的G3072A位点变异(G→A)对猪背膘厚和活体瘦肉率均存在显著或极显著影响,表现为遗传父本A等位基因的个体能够增加活体瘦肉率和减少背膘厚;在长×大杂交后代的背最长肌中,IGF2mRNA的表达量在遗传父本A等位基因的个体中显著高于遗传父本G等位基因的个体,在42和180日龄时达显著水平(P<0.05),而在70、90和120日龄时达极显著水平(P<0.01)。

辅助生殖技术子代印迹基因IGF2与H19mRNA表达的初步研究

目的通过研究辅助生殖技术(ART)子代印迹基因IGF2mRNA与H19的表达水平及其与出生情况的关系,初步评估ART操作对子代的生长发育情况及出生缺陷的影响,以探索ART操作的安全性。方法以58例ART子代(40例异卵双胎与18例单胎)作为研究组,同期32例自然妊娠子代(30例单胎与2例异卵双胎)作为对照组,记录母龄、分娩孕周、出生体重及有无出生缺陷等,收集新生儿脐带血,使用real-time PCR技术检测其印迹基因IGF2mRNA与H19的表达水平。结果所有纳入研究的新生儿均未发现有出生缺陷。研究组与对照组比较,印迹基因IGF2mRNA的表达差异有统计学意义(P<0.05),主要表现为ART双胎与自然妊娠单胎比较差异有统计学意义(P<0.05),单胎之间比较差异无统计学意义(P>0.05);研究组与对照组H19表达差异有统计学意义(P<0.05),但ART双胎/单胎与自然妊娠单胎比较H19表达差异无统计学意义。出生体重与H19表达水平呈负相关(P<0.05);分娩周数与IGF2表达水平呈负相关(P<0.05);印迹基因IGF2与H19表达水平呈正相关(P<0.05)。结论 ART双胎妊娠率较高,继而引起早产并低体重儿发生率较高,印迹基因表达水平的改变亦可能与此有关,但并未增加出生缺陷的风险,对于ART操作的远期安全性需要做更进一步的研究。

印迹基因H19和Igf2在子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中的异常表达及其意义

目的研究印迹基因H19和Igf2在子宫内膜异位症(内异症)患者子宫内膜的表达及临床意义。方法选择2011年1月至2012年8月至北京大学深圳医院生殖中心行试管助孕并已行宫腹腔镜检查的患者,其中证实为内异症的患者31例作为实验组,因男方因素不孕、女方因素完全正常的妇女33例作为对照组,收集分泌中期子宫内膜组织,采用实时定量聚合酶链反应方法(RT-PCR)测定两组子宫内膜组织H19和Igf2 mRNA表达水平。结果 H19和Igf2 mRNA在内异症患者子宫内膜组织中的平均表达量分别为49.909±46.970和8.747±5.451,在对照组中的平均表达量分别为19.728±23.990和0.513±0.973,H19和Igf2在内异症患者与正常女性子宫内膜组织中的表达差异均具有统计学意义(P=0.006和0.00)。结论印迹基因H19和Igf2可能与内异症性不孕有关。

牛IGF2基因多态性与大别山牛生长性状的相关性分析

[目的]分析IGF2基因多态性位点与大别山牛体尺性状的相关性。[方法]利用PCR和测序技术检测大别山牛群体中IGF2基因的多态性,利用SPSS 23.0软件分析其与体尺性状的相关性。[结果]在大别山牛群体中,IGF2基因第一内含子共检测到3个SNPs位点(g.22218G>A、g.22421C>T和g.22448G>T),3个SNPs位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),且均属于中度多态(0.25<PIC<0.50);相关性分析结果显示g.22218 G>A位点与大别山牛群体体斜长、胸围显著相关(P<0.05),与腹围极显著相关(P<0.01);g.22421C>T位点与大别山牛群体的体高和腰角宽显著相关(P<0.05),与腹围极显著相关(P<0.01);g.22448G>T位点与大别山牛群体的胸围显著相关(P<0.05),与腹围和腰角宽极显著相关(P<0.01)。[结论]IGF2基因第一内含子的g.22218 G>A、g.22421C>T和g.22448G>T位点多态性与大别山牛群体部分生长性状具有显著或极显著的相关性。

IGF2基因的遗传学特征与生物学意义

IGF2基因是最早发现的内源性印迹基因,其印迹异常参与了许多遗传病尤其肿瘤的发生,在胎儿发育、肿瘤细胞增殖等方面具有重要的调控作用。本文主要阐述了,IGF2基因的遗传学特征、表达机制、生物学意义及其与疾病发生的关系等。