密闭培养条件下小鼠早期胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化状态分析

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件.本文主要研究密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育过程中印迹基因Igf2/H19的印迹调控区(ICR)甲基化水平的影响.应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析小鼠2-细胞胚胎在密闭条件下分别培养24h、48h和72h后,相对应的发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平,以常规体外培养和体内发育的各阶段胚胎为对照.结果显示,密闭培养条件下,小鼠8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的Igf2/H19的ICR甲基化水平都低于常规体外培养的结果,且更明显低于体内发育的结果;同时发现,小鼠8-细胞胚胎密闭培养时,Igf2/H19的ICR甲基化水平最低.由此可见,密闭培养会引起小鼠植入前各发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平降低,并证明Igf2/H19的ICR甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的分子指标.

试探IGF2和H19基因与韦伯综合征的关系

笔者就韦伯综合征(Beckwith Wiedemannsyndrome,BWS)的特征,及IGF2与H19印迹基因各自生物学生性、印迹状况以及与BWS疾病的关系展开了详尽阐述。

重组腺病毒Ad-DT-A靶向治疗胰岛素样生长因子2基因组印迹丢失的肿瘤细胞株

目的构建携带胰岛素样生长因子2（IGF2）印迹系统的重组腺病毒，探讨其用于肿瘤靶向治疗的可行性。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增H19enhancer、DMD以及H19启动子序列，并克隆至pDC-312中；扩增出增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和白喉毒素A（DT．A）片段，分别插入到构建好的重组质粒中，构建成重组腺病毒穿梭质粒。重组腺病毒穿梭质粒与Ad5共转染，产生重组腺病毒Ad—EGFP和Ad—DT—A。以Ad—EGFP分别感染正常IGF2印迹（MOI）细胞GES．1和MCF-7以及IGF2印迹丢失（LOI）细胞HCT-8，荧光显微镜下观察各组细胞中EGFP的表达。通过检测腺病毒衣壳蛋白hexon基因的表达证实腺病毒的感染，采用逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）和Western blot方法检测Ad—DT—A感染后各组细胞中DT—A基因的表达；采用四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）法和流式细胞术检测Ad—DT—A体外抗肿瘤效应。构建皮下移植瘤裸鼠模型，研究Ad-DT-A在体内的抑瘤作用。结果所构建重组腺病毒Ad-EGFP感染各组细胞后，EGFP蛋白仅在IGF2LOI细胞HCT。8中表达。各组细胞经Ad—DT—A感染后，DT-A基因仅在HCT-8细胞中表达；且HCT-8细胞以每个细胞10PFU的Ad．DT-A感染72h后，其增殖活力降低至（75．4±6．4）％，凋亡率升高至（20．8±5．9）％。Ad-DT-A多点注射人HCT-8移植瘤内，Ad—DT—A能够有效抑制移植瘤的生长，抑瘤率达36．4％。结论成功构建了携带IGF2印迹系统和DT-A基因的重组腺病毒。重组腺病毒Ad—DT-A能够有效杀伤IGF2LOI肿瘤细胞，为依赖IGF2LOI的肿瘤靶向治疗开拓了新的途径。